Amputarea și regenerarea chimică a faringelui în Schmidtea mediterranea planară

rezumat

Planarian Schmidtea Mediterranea este un model excelent pentru studierea celulelor stem și a regenerării țesuturilor. Această publicație descrie o metodă de îndepărtare selectivă a unui organ, gâtul, prin expunerea animalelor la azida chimică de sodiu. Acest protocol descrie, de asemenea, metodele de monitorizare a regenerării gâtului.

Abstract

Planarii sunt viermi plati extrem de eficienti la regenerare. Acestea sunt datorate unui număr mare de celule stem care pot reacționa rapid la orice tip de leziune. Modelele comune de rănire la aceste animale îndepărtează cantități mari de țesut care deteriorează mai multe organe. Pentru a depăși această leziune extinsă a țesuturilor, descriem aici o metodă de îndepărtare specifică a unui singur organ, gâtul, în Schmidtea Mediterranea planară. Obținem acest lucru prin înmuierea animalelor într-o soluție care conține inhibitorul citocrom oxidazei azidă de sodiu. Expunerea scurtă la azidă de sodiu determină extrudarea gâtului animalului, ceea ce numim „amputare chimică”. Amputarea chimică îndepărtează întregul faringe și creează o mică rană în care faringele se află în intestin. După clătire extinsă, toate animalele amputate au regenerat un gât complet funcțional în aproximativ o săptămână. Celulele stem din restul corpului stimulează regenerarea noului gât. Aici oferim un protocol detaliat pentru a descrie amputarea chimică și metodele histologice și comportamentale pentru evaluarea amputării și regenerării cu succes.

Introducere

Regenerarea este un fenomen care are loc în tot regnul animal, cu capacități regenerative care variază de la regenerarea întregului corp la anumite nevertebrate până la capacități mai limitate la vertebrate 1. Înlocuirea țesuturilor funcționale este un proces complex și deseori implică refacerea simultană a mai multor tipuri de celule. De exemplu, membrele salamandrei, osteoblastele, condrocitele, celulele nervoase, mușchii și celulele epiteliale trebuie să se regenereze 2 înlocuite. În plus, aceste tipuri de celule nou create trebuie organizate corespunzător pentru a facilita noua funcție a membrului. Înțelegerea acestor procese complexe necesită tehnici care se concentrează pe regenerarea anumitor tipuri de celule și integrarea lor în organe.

Una dintre strategiile de simplificare a studiului răspunsurilor regenerative este ablația țintită a anumitor tipuri de celule sau colecții mai mari de țesuturi. De exemplu, expresia nitroreductazei în anumite tipuri de celule din peștele zebră duce la distrugerea lor după utilizarea metronidazolului 3, 4. În larvele de Drosophila, ablarea care exprimă gene pro-apoptotice sub promotori specifici țesutului care vizează anumite regiuni ale discului imaginal 5, 6. Ambele strategii provoacă daune rapide, dar controlate și au fost utilizate pentru a diseca mecanismele moleculare și celulare responsabile de regenerare.

În acest manuscris descriem o metodă de ablare selectivă a unui întreg organ numit faringe în mediteraneanul planarian Schmidtea. Planarii sunt un model clasic de regenerare, cunoscut pentru capacitatea lor regenerativă fertilă, în care chiar și cele mai mici fragmente de animale întregi 7, 8 cresc din nou. Au o populație mare, eterogenă, de celule stem formate din celule pluripotente și progenitori limitați de linie 9, 10, 11. Aceste celule se înmulțesc și se diferențiază pentru a înlocui orice țesut lipsă, inclusiv gâtul, sistemul nervos, digestiv și excretor, precum și celulele musculare și epiteliale 9, 10, 12. Știm că aceste celule stem inițiază regenerarea, nu înțelegem pe deplin mecanismele moleculare care le determină să înlocuiască aceste diferite tipuri de celule. Metodele rănite definite care pot declanșa reacții precise ale celulelor stem ajută la delimitarea acestui proces complex.

Faringele este un tub mare, cilindric, necesar hrănirii și conține neuroni, mușchi, epiteliu și celule secretoare 13, 29. De obicei ascuns într-un buzunar pe burtica animalului, acesta se extinde peste corpul individual al animalului pentru a se deschide, simțind prezența hranei. Pentru amputarea selectivă a faringelui, îmbibăm planarii într-o substanță chimică numită azidă de sodiu, un anestezic utilizat în mod obișnuit în C. elegans 14, 15, 16. Utilizarea sa în planuri a fost raportată pentru prima dată de Adler și colab., 2014-12. În câteva minute de la expunerea la azide de sodiu, planarii își extrudă faringii și, cu o agitare ușoară a gâtului, separă animalul. Această pierdere completă și selectivă a gâtului este ceea ce numim „amputare chimică”. La o săptămână după amputare, un gât complet funcțional este restaurat pe locul 12 Deoarece faringele este necesar pentru hrănire, regenerarea funcțională poate fi măsurată prin monitorizarea comportamentului hrănirii. În cele ce urmează descriem protocolul pentru amputarea chimică și pentru evaluarea regenerării gâtului și restabilirea comportamentului de hrănire.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

3. Evaluarea îndepărtării faringelui după amputare

Examinați animalele la microscop (cu mărire de 10-20X) pentru a vedea dacă a apărut o pată întunecată după deselectarea gâtului, ca în Figura 2Aafișate.
Alternativ, fixați și înălbiți animalele conform protocolului Pearson și colab. descris 20. Se înmoaie animalele peste noapte în 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) sau culturi tisulare conjugate cu streptavidină (1 mg/ml diluat 1: 500, 1x soluție salină tamponată cu fosfat cu 0,3% Triton-X). Animale pe diapozitive în 80% glicerol/20% 1 X soluție salină tamponată cu fosfat și imagine sub un stereomicroscop fluorescent (Fig. 2 b) montură.
Notă: Toate imaginile din acest manuscris au fost capturate pe un stereomicroscop fluorescent cu o țintă 1.0X.

4. Evaluarea regenerării faringelui prin măsurarea comportamentului alimentar

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

Expunerea la azidă de sodiu perturbă mobilitatea normală a planarilor, determinând animalele să se întindă și să se zvârcolească. Aceste mișcări forțează gâtul să iasă din partea ventrală a animalului și după aproximativ 6 min. în soluție de azidă de sodiu, se vede vârful alb al gâtului (Figura 1 b-stânga). Câteva minute mai târziu, animalele se contractă activ și extind complet gâtul forțându-l să iasă din corp. (Figura 1 b-Centru). Relaxați-vă aprox.11 min. după expunerea la azidă, animale și gât. În acest stadiu, forma clopotului tipic al gâtului este clar vizibilă (Figura 1 b-panoul din dreapta). Pentru o amputare simplă, este important să așteptați ca faringele să se relaxeze.

Deoarece un faringe este o masă de țesut mare, nepigmentată, elimină aspectul unei pete întunecate pe partea dorsală a animalului amputat (Figura 2A). Această regiune întunecată este o indicație vizuală a amputării cu succes a animalelor vii. Pata este vizibilă imediat după amputare și devine mai proeminent a doua zi. Pe măsură ce faringele se regenerează, această regiune se relaxează. Pentru a monitoriza mai atent regenerarea faringelui, animalele pot fi, de asemenea, colorate cu DAPI sau culturi de țesuturi conjugate cu streptavidină peste noapte (Fig. 2 b). Pentru a evalua cantitativ gradul de regenerare a gâtului, aria acestuia poate fi măsurată cu software-ul ImageJ.

ilustrația 1 . Expectorație și amputare faringiană. (A) Reprezentarea schematică a anatomiei planare. (B) Imaginile cu animale vii arată spută faringiană după înmuiere în azidă de sodiu 100 mM. Săgețile roșii marchează gâtul. Barele de scalare = 750 µm. (C) Imaginea animalelor vii (stânga) și schema circuitului (dreapta) a amputării cu pensete. Panourile prezintă două opțiuni diferite pentru apucarea gâtului. Burtica animalului este cu fața în sus. Barele de scalare = 500 µm. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.

Figura 2 . Evaluarea amputării și regenerării gâtului. (A) imagini reprezentative ale animalelor vii în anumite momente înainte și după amputare. Zona de mijloc arată pata întunecată în regiunea faringiană după amputare, evidențiată de câmpul alb punctat. Partea dorsală orientată în sus. Barele de scalare = 500 µm. (B) imagini reprezentative ale animalelor colorate cu Alexa488-streptavidină în anumite momente înainte și după amputare. Panoul din mijloc arată absența gâtului după amputare. Regiunea faringiană evidențiată de o casetă albă. Cu fața în sus. Bara de scalare = 500 µm. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.

Figura 3. Evaluarea regenerării gâtului. (A) Imagini și schema testului de hrănire efectuat prin plasarea a 25 pl de ficat în centrul unei cutii Petri de 60 mm. Diagrama circuitului (sus, stânga) și imaginea (mijloc) arată comportamentul de hrănire la animalele cu faringii intacte. Deasupra dreapta, poza animalului care a mâncat. Diagrama circuitului (în stânga jos) și imaginea (centrul) comportamentului de hrănire la animale la 1 zi după amputare. În partea dreaptă jos, animal care nu a mâncat. Bara de scalare = 750 µm. (B) Rezultatele testului de hrănire. Proporția de animale care au consumat alimente (cuantificată prin colorare roșie) în anumite momente după amputare. Pentru fiecare moment, n = 10 animale, repetate în trei exemplare. Bara de erori = SD Vă rugăm să faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei figuri.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

Acest protocol descrie o metodă de ablare selectivă a gâtului cu azidă de sodiu. Alte studii de ablație vizate la planari au folosit o intervenție chirurgicală modificată pentru îndepărtarea fotoreceptorilor 21 sau tratament farmacologic pentru ablarea neuronilor dopaminergici 22. Un mare avantaj al amputării chimice față de metodele existente este că nu necesită intervenție chirurgicală. Structura rigidă a gâtului în comparație cu restul corpului planar facilitează îndepărtarea completă a acestuia de la animal, care este un corp mult mai moale. Faringele separă, de asemenea, animalul la o mică joncțiune (esofag) 30 care unește faringele și intestinul, generând o rană mai reproductibilă decât cea indusă de un instrument chirurgical mai mare. Datorită proprietăților sale fizice și a conexiunii anatomice reduse cu restul animalului, îndepărtarea faringelui creează, prin urmare, răni mai omogene decât alte amputări chirurgicale.

Durata expunerii la azidă de sodiu este, de asemenea, critică pentru succesul acestei tehnici. Deși expunerea scurtă la azidă de sodiu nu afectează negativ planarii, perioade lungi de timp sunt otrăvitoare și vor ucide în cele din urmă animale. Se știe că azida de sodiu inhibă procesele dependente de energie prin inhibarea citocrom oxidazei 23,24. În plus, suprimă transcrierea și traducerea, probabil prin acumularea componentelor cheie ale acestor reacții în granulele de stres 25. La planari, expunerea la azidă de sodiu suprimă mitoza timp de 24 de ore, după care celulele continuă proliferarea 12. Modificări precum B. Limitarea duratei expunerii la azide, eliminarea azidei de sodiu cu o spălare completă și echilibrarea protecției la supratensiuni mitotice în proiectarea experimentală pot ajuta la depășirea acestor limite.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Dezvăluiri

Autorii nu au dezvăluit nimic.

Mulțumiri

Mulțumim lui Alejandro Sánchez Alvarado, care a asistat la optimizarea inițială și dezvoltarea acestei tehnici. Laboratorul Carolyn Adler este susținut de bani de la Universitatea Cornell.