Analiza expresiei genelor - Biologie

Analiza expresiei genelor se referă la o investigație a implementării informațiilor genetice (expresia genelor) folosind metode moleculare biologice și biochimice. Poate fi utilizat atât pentru transcrieri individuale, cât și pentru întregul transcriptom și permite să se facă afirmații calitative și cantitative despre activitatea genelor. În timp ce în primul caz trebuie să fie cunoscute doar informațiile secvenței transcrierii care urmează să fie examinate, întreaga informație a secvenței transcriptomului este necesară pentru analiza transcriptomului.

În biologia moleculară, activitatea și expresia a mii de gene pot fi măsurate simultan cu ajutorul analizei expresiei genelor, care permite o imagine de ansamblu a funcțiilor celulare. Profilurile de expresie genică pot fi utilizate, de exemplu, pentru a identifica celulele care se află în faza activă de diviziune sau pentru a arăta răspunsul celulelor la un tratament specific. Multe astfel de experimente examinează întregul genom, i. fiecare genă dintr-o celulă specifică.

Tehnica microarray-ului ADN [1] măsoară activitatea relativă a genelor țintă identificate anterior. Metode bazate pe secvențe, cum ar fi analiza în serie a expresiei genice (SAGE, SuperSAGE) sunt, de asemenea, utilizate pentru analiza expresiei genice. SuperSAGE este deosebit de precis, deoarece această metodă nu se limitează la gene predefinite, ci poate măsura orice genă activă. Odată cu introducerea metodelor de secvențiere de următoarea generație, analiza expresiei bazată pe secvență s-a bucurat de o popularitate crescândă ca alternativă digitală la microarrays. Cu toate acestea, microarrays-urile au fost utilizate mai frecvent, după cum se arată în utilizarea acestei metode în 17.000 de articole PubMed până în 2006.

Este o genă exprimată deloc în circumstanțele examinate?
În ce celule are loc expresia (de exemplu hibridizarea in situ)?

Cât de mare este diferența de expresie comparativ cu o referință definită?
- sănătos vs. celule bolnave
- Tipul sălbatic vs. Celule mutante
- nestimulat vs. celule stimulate

În funcție de metodă, se analizează produsele diferitelor niveluri de expresie genică:

Metode

Odată cu hibridizarea in situ, ARN-ul specific secvenței unei gene/set de gene definite este detectat în țesut și se determină modelul local de exprimare a genei.

În metoda Northern blot, ARN-ul este mai întâi izolat și separat electroforetic în funcție de dimensiunea sa într-un gel. După transferarea acestuia către o membrană (blotare), secvența de ARN căutată este detectată de sonde marcate (radioizotopi, coloranți fluorescenți) realizate din ARN sau ADN complementar prin legare complementară. De regulă, doar un număr mic de secvențe sunt examinate simultan.

În microarrays sau macroarrays ADN, cantitatea de ARNm dintr-un număr mare de gene din celulele unei culturi/țesuturi poate fi determinată simultan. În acest scop, ARNm este izolat și transcris în ADNc. Cu această metodă, detectarea are loc prin hibridizarea complementară a ADNc marcat (radioizotopi, coloranți fluorescenți) cu sondele matricei de ADN.

Cu analiza în serie a expresiei genelor (SAGE) și în special SuperSAGE, expresia teoretic a tuturor genelor unei celule poate fi determinată foarte precis prin generarea unei bucăți scurte de secvență (așa-numita „etichetă” = etichetă) din fiecare transcriere și cât mai multe posibil dintre aceste etichete sunt secvențiate. Avantajul față de microarrays este cuantificarea mult mai precisă a transcrierilor, precum și posibilitatea (în special cu SuperSAGE) de a identifica noi transcrieri (de exemplu, acizi ribonucleici necodificatori, cum ar fi microARN-urile sau ARN-urile antisens) și de a examina organismele cu genomi necunoscuți anterior.

PCR cantitativă în timp real este o variantă a reacției în lanț a polimerazei (PCR). Coloranții sau sondele speciale adăugate la amestecul de reacție monitorizează concentrația produsului în timpul PCR. Schimbarea concentrației în timp permite să se tragă concluzii despre concentrația inițială a acidului nucleic în cauză.

Cu metoda Western blot, proteinele sunt separate în funcție de proprietăți diferite, cum ar fi dimensiunea, sarcina electrică sau punctul izoelectric și apoi detectate cu anticorpi. De regulă, doar un număr gestionabil de produse genetice este examinat simultan.

Analiza diferențială a gelurilor 2D permite exprimarea a până la 10.000 de proteine în același timp. În acest scop, extractele de proteine sunt obținute din culturi/țesuturi celulare, separate bidimensional în funcție de punctul izoelectric și de masa moleculară și detectate și cuantificate prin intermediul marcării sau a diverselor tehnici de colorare (fluorescență). Intensitățile determinate ale diferitelor eșantioane sunt comparate între ele și astfel comportamentul de exprimare este monitorizat în condiții diferite.

În matricele de proteine, analog matricelor de ADN, se examinează cantitatea de anumite proteine. Numeroasele interacțiuni dintre proteine și alte molecule sunt utilizate pentru detectare: B. Interacțiune enzimă-substrat, anticorp-antigen sau receptor-mesager.

În ultimii ani, analiza spectrometrică de masă a amestecurilor de proteine a devenit din ce în ce mai importantă. Folosind „abundența spectrală”, peptidele din bucăți de proteine sunt numărate, similar cu fragmentele de ADN ale ARN-urilor existente în SAGE, iar frecvența lor este cuantificată. Alte metode folosesc intensitatea semnalului anumitor peptide din spectrul de masă ca măsură a frecvenței.

Multe metode folosesc coloranți fluorescenți care sunt cuplați la sonde (sonde ARN, anticorpi etc.) și făcute vizibile prin spectroscopie fluorescentă sau microscopie fluorescentă. Acesta din urmă oferă avantajul unei rezoluții spațiale ridicate. În plus, sunt utilizate sonde marcate radioactiv sau cele care transformă cromogeni în coloranți prin intermediul enzimelor cuplate.

Comparație cu proteomică

Genomul uman conține în jur de 25.000 de gene care lucrează împreună pentru a crea aproximativ 1.000.000 de proteine diferite. Această diversitate apare în principal prin modificări post-translaționale, astfel încât o singură genă poate servi drept șablon pentru multe versiuni diferite ale unei proteine. Aproximativ 2000 de proteine [5] (0,2% din total) pot fi identificate într-un singur experiment de spectrometrie de masă. Cunoașterea proteinelor individuale pe care le produce o celulă (proteomică) este mai relevantă decât cunoașterea cantității de ARNm produsă de fiecare genă. Cu toate acestea, analiza expresiei genelor oferă cea mai bună imagine de ansamblu posibilă care poate fi obținută într-un singur experiment.

Folosiți pentru a dezvolta și testa ipoteze

restricții

Validarea metodelor cu randament ridicat

Atât microarrays-urile de ADN, cât și qPCR utilizează legarea preferată a secvențelor complementare de acid nucleic („împerecherea bazelor”) și ambele metode sunt utilizate, adesea succesiv, pentru a crea profiluri de expresie genică. În timp ce microarrays-urile de ADN au o rată de transfer mare, le lipsește precizia cantitativă ridicată a qPCR. Cu toate acestea, în același timp cu care este nevoie pentru a determina expresia a câteva zeci de gene cu qPCR, întregul genom poate fi examinat folosind microarrays de ADN. Din acest motiv, este adesea logic să efectuați mai întâi o analiză semicantitativă a microarray-ului ADN pentru a identifica genele candidate, care pot fi apoi validate și mai precis cuantificate utilizând qPCR. Experimente suplimentare, cum ar fi Western blotting a proteinelor genelor exprimate diferențial, pot ajuta la fundamentarea rezultatelor analizei expresiei genelor, deoarece concentrațiile de ARNm nu se corelează neapărat cu cantitatea de proteină exprimată.

analize statistice

Adnotare genică

Cu ajutorul metodelor statistice, genele ale căror produse se schimbă în condiții experimentale pot fi identificate în mod fiabil. Pentru o interpretare semnificativă a profilurilor de expresie, este esențial să știm ce proteină este codificată de ce genă și ce funcție are. Acest proces se numește adnotare genică. Unele adnotări sunt mai fiabile decât altele și, uneori, sunt complet absente. Bazele de date cu adnotări genetice se schimbă constant, iar bazele de date diferite folosesc nume diferite pentru aceeași proteină, reflectând o schimbare în înțelegerea funcției sale. Utilizarea unei nomenclaturi genetice standardizate evită problema denumirii diferite, dar atribuirea exactă a transcrierilor la gene [13] [14] rămâne o provocare importantă.

Clasificarea genelor reglementate

Următorul pas după identificarea unui grup de gene reglementate diferențial este de a căuta modele în cadrul acelui grup. Proteinele pentru care codifică aceste gene au funcții similare? Sunt asemănătoare din punct de vedere chimic? Sunt situate în compartimente celulare similare? Analiza ontologiei genice oferă un mod comun de definire a acestor relații. Ontologia genică începe cu o categorie superioară foarte largă, de ex. „Proces metabolic”, apoi le împarte în subcategorii mai mici, cum ar fi „Metabolismul carbohidraților”, care la rândul său poate fi împărțit în subgrupuri mai specifice, cum ar fi „Fosforilarea inozitolului și a derivaților”. Pe lângă funcția lor biologică, proprietățile chimice și localizarea celulară, genele au și alte proprietăți. De exemplu, genele pot fi clasificate în grupuri pe baza relației lor cu alte gene, a legăturii lor cu boli sau a interacțiunii lor cu medicamente sau toxine. Baza de date cu semnături moleculare [15] și baza de date comparativă de toxicogenomică [16] permit clasificarea genelor într-o mare varietate de moduri.

Recunoașterea tiparului între gene reglementate

Când genele reglementate sunt sortate în funcție de ceea ce sunt și de ceea ce fac, pot apărea relații importante între diferite gene [18]. De exemplu, puteți obține o indicație că o anumită genă codifică o proteină care creează o enzimă care la rândul său activează o proteină care reglează o a doua genă de pe lista noastră. Această a doua genă ar putea fi un factor de transcripție care, la rândul său, reglează o altă dintre genele noastre candidate. Observând aceste conexiuni încrucișate, putem presupune că acestea sunt mai mult decât asociații aleatorii și că toate aceste gene se află pe lista noastră, deoarece fac parte dintr-un proces biologic de bază. Pe de altă parte, genele care sunt independente una de cealaltă și care sunt selectate complet aleatoriu ar putea da impresia că fac parte dintr-un proces comun, deși nu este cazul.

Relațiile cauză și efect

Folosirea modelelor pentru a recunoaște genele reglementate

Concluzii

Analiza expresiei genelor oferă noi informații despre cum se comportă genele în diferite condiții. În general, tehnicile de microarray produc profile de expresie fiabile [24]. Pe baza acestor date, pot fi întocmite noi ipoteze biologice sau verificate ipotezele existente. Cu toate acestea, scopul și complexitatea acestor experimente duc adesea la o varietate de interpretări diferite. În multe cazuri, analiza datelor profilurilor de expresie necesită mult mai mult timp și efort decât experimentul original pentru a genera datele. Mulți oameni de știință folosesc mai multe metode statistice și analize preliminare ale datelor și consultă biostatisticieni sau alți experți în domeniul tehnologiei microarray înainte de a publica rezultatele analizelor de expresie genetică. Un set experimental bun, un număr adecvat de replici biologice și experimente repetate joacă un rol cheie în efectuarea analizelor de succes ale expresiei genelor.