Biogeneza aerobă a nanoparticulelor de seleniu de către enterobacter cloacae z0206 ca urmare a

subiecte

abstract

În studiul de față, am examinat capacitatea Enterobacter cloacae Z0206 de a reduce selenitul de sodiu toxic și mecanismul acestui proces. S-a constatat că E. cloacae Z0206 reduce complet până la 10 mM selenit la seleniu elementar (Se °) și formează nanoparticule de seleniu (SeNPs) în condiții aerobe. Efectorul reducător de selenită al celulei E. cloacae Z0206 ar trebui să fie o enzimă localizată pe membrană. Analiza proteomului iTRAQ a arătat că selenitul a indus o creștere semnificativă a expresiei fumarat reductazei. În plus, atât adăugarea fumaratului la bulion, cât și oprirea fumarat reductazei (frd) au redus semnificativ rata de reducere a selenitului, dezvăluind un rol nerecunoscut anterior al fumatului reductazei E. cloacae Z0206 în reducerea selenitului. În schimb, răspunsurile mediate de glutation de tip Painter nu au fost principala cale de reducere a selenitului. Pe scurt, E. cloacae Z0206 a redus efectiv selenitul la Se ° folosind fumarat reductază și a format SeNPs; Această abilitate ar putea fi utilizată pentru a dezvolta un bioreactor pentru tratamentul impurităților Se și pentru biosinteza SeNP în viitor.

introducere

S-a demonstrat că reducerea selenitei la Se ° este mediată de tioli (reacții pitorești) în citoplasmă ca parte a unei strategii de detoxifiere microbiană 29. Selenitul reacționează cu GSH și formează selenodiglutation (GS-Se-SG), care este redus în continuare la glutation selenopersulfură (GS-Se -) de NADPH-glutation reductază. GS-Se - este un intermediar instabil și suferă o reacție de hidroliză pentru a forma Se ° și GSH redus. În plus față de răspunsurile pitorești, s-a raportat că o serie de reductaze terminale pentru respirația anaerobă, două nitriți reductaze, o sulfit reductază inductibilă și o fumarat reductază sunt capabile să reducă selenitul în celulele 30, 31, 32. 33 .

S-a demonstrat că Enterobacter cloacae SLD1a-1, un anaerob facultativ care respiră selenat, catalizează reducerea selenatului și selenitului la Se ° 12, 34, 35 1, 5 mM). S-a dovedit că reducerea selenatului este mediată de o molibdoenzimă legată de membrană 36, 37, dar mecanismul de reducere a selenitului din această tulpină nu a fost elucidat. În plus, toate testele de reducere a selenitei care implică E. cloacae au fost efectuate într-un mediu anaerob, iar capacitatea de reducere a selenitei de E. cloacae nu a fost încă testată în condiții aerobe. S-a constatat că E. cloacae Z0206, o tulpină pe care am izolat-o din ciuperca Reishi (Ganoderma lucidum) „carne” 38, are o rezistență excelentă la selenită și tolerează peste 100 mM selenită. În studiul de față, am examinat (i) capacitatea E. cloacae Z0206 de a reduce selenitul în condiții aerobe, (ii) proprietățile și localizarea SeNP-urilor produse și (iii) mecanismul de reducere a selenitei în tulpina Z0206.

rezultate si discutii

Profilul de creștere și capacitatea de reducere a selenitului E. cloacae Z0206 la diferite concentrații de selenit

Creșterea și reducerea selenitului E. cloacae Z0206 în prezența diferitelor concentrații de selenit. ( A. Modificări evidente în bulionul consumat. ( B. ) Profil de creștere la diferite concentrații de selenit. Probele de 1 ml de cultură bacteriană au fost colectate la diferite intervale de timp de creștere bacteriană și apoi centrifugate timp de 10 minute la 4 ° C și 10.000 x g. Proteina a fost extrasă din peletă folosind un kit de testare pentru extracția proteinelor bacteriene totale. Creșterea bacteriană a fost măsurată prin cuantificarea proteinei celulare totale. S-a determinat concentrația de proteine din extractele de celule bacteriene. ( C. ) Cantitatea de bacterii la momentul respectiv 96 h. ( D. ) Modificări dinamice ale reziduului de selenit din bulion. ( E. ) Investigația cinetică a reducerii selenitului de către E. cloacae Z0206 sub diferite concentrații de selenit. Diagramele liniare și diagramele cu bare sunt prezentate ca medie ± SD, ** P

Caracterizarea și localizarea SeNPs sintetizate de E. cloacae Z0206. ( A. ) Imaginea SEM a E. cloacae Z0206 și SeNPs. ( B. ) Analiza EDX a conținutului de carbon, azot, oxigen și seleniu în intervalul de ( A. ). ( C. ) Analiza cartografică elementară a distribuției seleniului, carbonului, oxigenului și azotului în intervalul ( A. ). ( D. ) Imagini TEM ale E. cloacae Z0206 și SeNPs. ( E. ) Analiza EDX a particulelor 1 și 2 în ( D. ). ( F. ) Se 3D XPS de înaltă rezoluție de SeNPs purificate, sintetizate din E. cloacae Z0206.

Capacitatea de reducere a selenitei a diferitelor fracții celulare din celulele E. cloacae Z0206

Capacitatea de reducere a selenitei diferitelor fracții de E. cloacae Z0206. Capacitatea de reducere a selenitei a bacteriei a fost estimată utilizând următorul amestec de reacție: 100 ug proteină, 10 mM selenită și 10 mM NADH în 200 ui Tris-HCI (pH 7,5). Amestecul de reacție a fost incubat la 37 ° C timp de 8 ore. Amestecul de reacție cu întreaga fracțiune celulară și fără selenit a servit ca un control pozitiv sau negativ.

Analiza iTRAQ a proteinelor E. cloacae Z0206 ca răspuns la selenit

Dintre proteinele identificate, selenitul a indus o creștere de 2,42 ori a frecvenței fumarat reductazei (Tabelul 1). Li și colab. 33 a arătat că reducerea selenitului în Shewanella oneidensis MR-1 este mediată de fumarat reductază, ceea ce indică faptul că fumarat reductază poate juca un rol în procesul de reducere a selenitului în E. cloacae Z0206. Cu toate acestea, cele mai frecvent așteptate proteine antioxidante, cum ar fi glutation sintetaza, glutation reductaza, glutation disulfid reductaza, tioredoxina, tioredoxin reductaza și tiol peroxidaza dependentă de tioredoxină, nu au prezentat modificări semnificative în răspunsul la tratamentul cu selenită (vezi Tabelul S2, Informații de susținere).

Analiza frecvenței ARNm a genelor selectate

Pentru a verifica rezultatele analizei iTRAQ, s-a evaluat frecvența ARNm a enzimei fumarat reductază (frd) și a enzimelor antioxidante glutation sintetază (gsh A), glutation reductază (gor), tioredoxină (trx A) și tioredoxin reductază (trx B). Așa cum se arată în figura 4, expresia mARN a gsh A, gor, trx A și trx B în celule după stimularea prin selenit nu a fost diferită de cea dinaintea tratamentului cu selenită. Cu toate acestea, tratamentul cu selenită a promovat expresia ARNm a frd într-o manieră dependentă de timp. Aceste date au confirmat faptul că E. cloacae poate reduce selenitul Z0206 la Se 0 prin fumarat reductază în loc de o reacție mediată de tip GSH.

Influența selenitei asupra transcrierii fumarat reductazei și a enzimelor implicate în reacțiile picturale. O cultură peste noapte de E. cloacae Z0206 a fost ajustată la OD 600 = 1 și diluată în bulion proaspăt (1%). Când cultura a ajuns la faza staționară, a fost prelevată o probă de 2 ml din cultură (ca martor fără Se). Apoi, 500 µm S-a adăugat 1 alicot din soluția stoc de selenit de sodiu (1 M) și cultura a fost incubată încă 120 de minute. Probele au fost colectate la 30 minute, 60 minute și 120 minute după adăugarea de selenit. * P

Influența BSO asupra creșterii și reducerii selenitului în E. cloacae Z0206. ( A. ) Creșterea E. cloacae Z0206 în prezența 1,5 mM, 3,0 mM și 5,0 mM BSO. Celulele au fost apoi incubate în prezența selenitei 5 mM cu adăugarea de 0 mM, 1,5 mM sau 3,0 mM BSO. Probele au fost prelevate în diferite momente pentru a determina reziduurile de selenit și probele de celule au fost prelevate la 24 de ore, 48 de ore și 72 de ore pentru a măsura concentrațiile intracelulare de GSH. ( B. ) Reducerea selenitei în prezența BSO. Rezultatul a fost transformat într-un procent din concentrația inițială de selenit. ( C. ) Efectul BSO asupra concentrațiilor intracelulare de GSH. * P 33 exista și fumarat reductaza ar putea fi principala cale de reducere a selenitei în E. cloacae Z0206.

Metode

Tulpina bacteriană Z0206 și condițiile de cultură

E. cloacae Z0206, o tulpină pe care o izolam anterior 38, se afla într-un bulion optimizat (zaharoză 25, triptonă 5, extract de drojdie 5, K 2 HPO 4 · 3H 2 O 2, 62, KH 2 PO 4 1, MgSO 4 0,5 in) cultivat g L -1) la 32 ° C și 250 rpm.

Creșterea bacteriană sub stres selenitic

Efectul selenitei asupra creșterii E. cloacae Z0206 a fost determinat în prezența 0 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM și 15 mM selenit de sodiu. Selenita de sodiu a fost preparată sub formă de soluție stoc 1 M și sterilizată prin filtrare. Apoi, flacoane Erlenmeyer de 500 ml conținând 100 ml bulion au fost suplimentate cu concentrații crescânde de selenit (0 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM și 15 mM) și o cultură bacteriană peste noapte a fost redusă la OD 600 set = 0,5 și inoculat (dimensiunea inoculului 1%) la bulionul menționat mai sus conținând diferite concentrații de selenit, urmat de incubare la 32 ° C, 250 rpm timp de 96 h.

Determinarea concentrației de selenit

Cultura a fost colectată și centrifugată la 10.000 x g timp de 10 minute. Supernatantul a fost colectat pentru a detecta selenitul rezidual prin metoda fluorometrică 2,3-diaminonaftalenă 41. Informații suplimentare despre detectarea selenitei pot fi găsite în secțiunea 1.2 sub „Informații suplimentare”.

Analiza SEM și EDX

Au fost colectate culturi de Z0206 în prezența diferitelor concentrații de selenit (0mM, 0,5mM, 1mM, 5mM, 10mM și 15mM). Aceste probe au fost centrifugate la 4 ° C și 12.000 x g timp de 15 minute, iar apoi peletele au fost spălate (0,1 M PBS), fixate, uscate și acoperite cu pulverizator, urmate de observare sub SEM. Hărțile de compoziție a elementelor din zonele selectate au fost analizate cu sistemul EDX.

Analiza TEM și EDX

Au fost colectate culturi de Z0206 cultivate în prezența diferitelor concentrații de selenit (0mM, 0,5mM, 1mM, 5mM, 10mM și 15mM). Aceste probe au fost centrifugate timp de 15 minute la 4 ° C și 12.000 × g, iar apoi peletele au fost spălate (0,1 M PBS), fixate, uscate și încorporate. Secțiunile ultra-subțiri de 100 nm au fost tăiate și colorate, urmate de observare sub TEM. Compoziția elementară a particulelor selectate a fost analizată cu sistemul EDX.

Vezi analiza valenței particulelor

E. cloacae Z0206 a fost cultivat în prezența 5 mM selenit timp de 72 de ore la 32 ° C și 250 rpm. Particulele de seleniu au fost obținute din cultură în conformitate cu metoda descrisă de Dobias și colab. Protocol dezvoltat detașat. 42. cu puțină schimbare. Pe scurt, cultura a fost decantată, urmată de o centrifugare simplă la 4 ° C la 8.000 x g timp de 10 minute pentru a separa biomasa suspendată. Particulele de Se colectate prezente în supernatant din etapa de centrifugare anterioară au fost concentrate prin centrifugare la 4 ° C și 20.000 x g timp de 15 minute. Peleta a fost apoi liofilizată și analizată folosind XPS.

Separarea fracțiilor celulare și determinarea activității de reducere a selenitului

O cultură E. cloacae Z0206 crescută în fază exponențială fără selenit a fost colectată și centrifugată timp de 10 minute la 4 ° C și 10.000 x g. Supernatantul a fost apoi colectat și filtrat folosind un filtru de 0,2 um. Apoi, peleta a fost spălată de două ori cu 10 mM Tris-HCI (pH 7,5) și resuspendată în același tampon pentru sonicare, urmată de centrifugare la 4 ° C la 6.000 x g timp de 10 minute pentru a separa celulele neîntrerupte. Apoi, supernatantul a fost centrifugat la 4 ° C la 25.000 × g timp de 40 de minute pentru a separa fracțiile citoplasmatice (supernatant) și membrana (pelet). Concentrația de proteine a fost măsurată cu un kit de testare BCA.

Analiza RT-PCR

ARN-ul a fost extras cu RNeasy Protect Bacteria Mini Kit. ARN-ul total a fost supus unei reacții de transcripție inversă folosind un kit de transcripție inversă Quanti Tect. PCR cantitativă a fost efectuată cu un sistem de PCR în timp real StepOne Plus ™ utilizând un FastStart Universal SYBR Green Master (ROX).

Determinarea concentrațiilor intracelulare de GSH

Celulele colectate din experiment asupra „Efectului BSO asupra reducerii selenitei în E. cloacae Z0206” la punctele de timp 24 h, 48 h și 72 h au fost concentrate prin centrifugare la 10.000 × g, 4 ° C timp de 10 minute și resuspendat în 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), după care celulele au fost întrerupte folosind ultrasunete. Celulele întrerupte au fost centrifugate la 20.000 x g timp de 15 minute și supernatanții au fost colectați pentru a determina concentrația de GSH folosind un kit de testare a glutationului total.

Construcția mutantului Δ frd

Sistemul & Dgr; mutantul frd a fost construit după cum sa raportat în altă parte 43. Pe scurt, un fragment de fuziune genică frd a fost amplificat și ligat prin PCR, apoi ligat cu pLP12 și ulterior transformat în Escherichia coli β2163. Plasmidele rezultate au fost introduse în E. cloacae Z0206 prin conjugare cu E. coli β2163. După două runde de selecție, mutantul care poartă gena frd ștearsă a fost validat prin PCR folosind primerii care au corespuns secvențelor înainte și după ștergere (vezi S4 în Informații suplimentare), și apoi secvențiat.

statistici

Analiza unică a varianței (ANOVA) urmată de testul de comparație multiplă LSD a fost utilizată pentru a determina semnificația statistică pentru comparații multiple, iar testul t Student a fost utilizat pentru comparații în perechi. P