Calea de încărcare a porții unui canal de potasiu asociat epilepsiei acceptă liganzi chimici

• subiecte
• abstract
• introducere
• Rezultate
• Roluri esențiale ale fenilalaninei conservate (F137) în activitatea ztz240
• Identificarea mai multor reziduuri critice în KCNQ2-VSD
• Model structural al legării ztz240 la KCNQ2-VSD
• Descoperirea de noi activatori pentru buzunarul de legare ztz240
• Activitatea anti-epilepsie a activatorilor care vizează calea de încărcare a porții
• discuţie
• Informatii suplimentare
• Fișiere PDF
• Informații suplimentare, Figura S1
• Informații suplimentare, Figura S2
• Informații suplimentare, Figura S3
• Informații suplimentare, Figura S4
• Informații suplimentare, Figura S5
• Informații suplimentare, Figura S6
• Informații suplimentare, tabelul S1
• Informații suplimentare, tabelul S2
• Videoclipuri
• Informații suplimentare, film S1

Video: Jeep Wrangler Hitch Mounted Cargo Rack XL (1987-2016 YJ, TJ & JK) Recenzie și instalare (noiembrie 2020).

subiecte

abstract

introducere

Rezultate

Roluri esențiale ale fenilalaninei conservate (F137) în activitatea ztz240

Identificarea mai multor reziduuri critice în KCNQ2-VSD

F137 se află în mijlocul segmentului S2 al KCNQ2 VSD. Am proiectat mai mulți mutanți pentru rămășițele care acoperă VSD. Printre mutațiile funcționale, E130A, I134A, G138A, R207W și R210A au scăzut dramatic activitatea de potențare a ztz240 în toate cele trei aspecte majore. Au redus creșterea raportului de amplitudine curent spre exterior (I/I 0) și au împiedicat sau atenuat deplasarea la stânga a curbei GV (ΔV 1/2) și încetinirea dezactivării (Figura 2). Curenții de coadă aproape suprapusi ai acestor mutanți cu și fără ztz240 arată în mod clar efectele reduse asupra dezactivării (informații suplimentare, tabelul S1). În schimb, mutațiile S105A și M174A au diminuat deplasarea la stânga a curbei GV, dar nu au redus raportul I/I 0 și nici nu au împiedicat încetinirea dezactivării (Figura 2 și informații suplimentare, Tabelul S1). Identificarea mai multor reziduuri esențiale arată în plus importanța VSD pentru activitatea ztz240.

Identificarea mai multor reziduuri critice în KCNQ2-VSD pentru activitatea ztz240. (A) Urme reprezentative ale mutanților critici identificați cu și fără 10 μM ztz240. (B) Efecte de 10 μM ztz240 asupra amplitudinii curentei externe a mutanților VSD (n> 3). Fiecare situs de mutație este indicat pe baza regiunilor transmembranare prezise. Linia punctată indică un nivel de potențare de 10 μM ztz240 pe canalul KCNQ2 de tip sălbatic. Potențialul de testare este de +50 mV. (C) Efectele a 10 μM ztz240 asupra V 1/2 a mutanților VSD (n> 3). Δ V 1/2 indică modificarea în V 1/2 după aplicarea ztz240. ΔV1/2 = V1/2 în prezența ztz240 - V1/2 în control.

Model structural al legării ztz240 la KCNQ2-VSD

Deoarece structurile experimentale ale KCNQ2 și complexele sale cu alți liganzi nu au fost determinate, este dificil să construim un model structural pentru interacțiunea ztz240-KCNQ2. În consecință, a fost utilizată o strategie ierarhică pentru a construi modelul structural prin utilizarea extinsă a modelării omologice, a andocării moleculare și a simularii MD în coroborare cu mutageneză și determinări electrofiziologice. Rezultatul mutagenezei sugerează că buzunarul potențial de legare al ztz240 este situat mai degrabă în VSD decât în ​​alte domenii (Figura 1). Alte experimente electrofiziologice arată că ztz240 se leagă de VSD în stare deschisă (informații suplimentare, Figura S3). Prin urmare, am creat mai întâi un model tridimensional (3D) pentru domeniul transmembranar al KCNQ2 bazat pe informațiile structurale ale canalului deschis Kv1.2 29, 30, 31 cu Discovery Studio 2.6 (informații suplimentare, Figura S1B).

Modelul de legătură ztz240 cu VSD. (A, B) General (A) și detaliat (B) Vizualizări ale interacțiunilor dintre ztz240 și VSD. ztz240 și reziduurile sunt prezentate sub formă de bile. Atomii de carbon, oxigen, azot, clor, fluor și hidrogen din ztz240 sunt de culoare albastru deschis, roșu, albastru închis, verde, portocaliu și respectiv alb. Doar câțiva atomi cheie de hidrogen sunt arătați pentru claritate. Legăturile de hidrogen sau interacțiunile electrostatice sunt indicate prin linii roșii. Interacțiunea CH-π și legătura halogenă sunt indicate prin linii negre și, respectiv, verzi. (C) Structura buzunarului de legare extrasă din modelele structurale ale complexelor ligand-VSD. Liganzii au fost eliminați pentru claritate. Suprafața sacului este prezentată în galben. În partea dreaptă sunt afișate trei secțiuni transversale ale sacului din exterior. Reziduurile sunt prezentate sub formă de bastoane. „Out” și „In” indică laturile exterioare și interioare ale membranei celulare.

Majoritatea reziduurilor critice care acoperă buzunarul de legare se află în S2 și S4, cum ar fi E130, I134, F137, G138, R207 și R210, în timp ce foarte puține reziduuri din S1 și S3 afectează conexiunea, cum ar fi S105 și M174 (Figura 3)) care nu sunt conservate în izoformele KCNQ. Pentru a evalua în continuare rolul reziduurilor în segmentele externe ale S1 și S3 în activarea ztz240, resturile rămase, cu excepția celor enumerate în 2B și 2C, au fost examinate prin scanarea alaninei și niciuna dintre ele nu a afectat în mod semnificativ activitatea ztz240 ( Informații suplimentare, tabelul S1)). Aceste mutații suplimentare și determinări electrofiziologice validează retrospectiv modelul nostru de legare ztz240-KCNQ2 din nou.

Modelul interacțiunii ztz240-KCNQ2 descrie în mod clar un buzunar larg în VSD care se extinde de la gura extracelulară a VSD la R210 (Figura 3C). Acest posibil buzunar de legare ztz240 în KCNQ2 se suprapune parțial cu regiunile corespunzătoare ale căilor de încărcare a porții canalelor himerice Shaker și Kv1.2-2.1, deși este mai expansiv și mai profund (1A și 3C) 5, 6, 7, 8 9, 10, 11, 12, 14, 15. Această constatare este în concordanță cu studiile anterioare care sugerează că VSD-ul conductelor Kv ar putea fi site-uri drogabile 19, 20. Studiul nostru a constatat, de asemenea, că calea de încărcare a porții KCNQ2 ar putea avea o nouă funcționalitate care acționează ca un buzunar direct de legare pentru activatorii existenți și noi, precum ztz240 și noii compuși descoperiți în acest studiu (vezi mai jos).

Descoperirea de noi activatori pentru buzunarul de legare ztz240

Screeningul virtual bazat pe structură identifică activatorii cu diferite chimiotipuri. (A) Creșterea amplitudinii curentului extern în prezența compusului așa cum este indicat. Potențialul de testare este de -10 mV. Linia punctată indică un nivel de exponențiere 1 (adică fără exponențiere). (B) Curbele doză-răspuns ale YG002, YG025 și YG027 (n> 3 pentru fiecare punct de date). (C) Structurile chimice ale activatorilor descoperiți. Fragmentele care sunt orientate spre capătul intracelular al VSD sunt evidențiate în portocaliu. (D) Vedere generală a modelelor de legare suprapuse a nouă activatori identificați cu VSD.

Activitatea anti-epilepsie a activatorilor care vizează calea de încărcare a porții

A fost efectuată o analiză primară de screening anti-epilepsie pentru a evalua activitatea acestor compuși la șoareci utilizând modelul de criză indusă de Electroshock maxim (MES). Dintre activatorii testați, ztz240, YG007 și YG018 au prezentat o rată de protecție> 50% și, prin urmare, au fost selectați pentru investigații suplimentare în modele de convulsii induse de MES și pentilenetetrazol (PTZ) (informații suplimentare, tabelul S2). Retigabina a fost întreruptă ca un control pozitiv. Toți cei trei compuși au prezentat o activitate anti-epilepsie excelentă la ambele modele. În modelul de criză indusă de MES, administrarea unei doze unice a celor trei compuși a împiedicat în mod semnificativ alungirea picioarelor posterioare tonice. Ratele de protecție (100%, 90% și 90%) sunt comparabile cu cele ale retigabinei (Tabelul 1). În modelul de convulsii induse de PTZ, cei trei compuși au prezentat o activitate anti-epilepsie comparabilă cu cea a retigabinei. O doză unică din acești compuși nu numai că a întârziat semnificativ latența clonei, dar a scăzut și incidența convulsiilor tonico-clonice generalizate (GTCS) și a mortalității (Tabelul 2).

discuţie

Calea de încărcare a porții a canalului KCNQ2 acceptă liganzi chimici. (A) Detalii despre modul în care activatorii interacționează și influențează R207 și R210 atunci când sunt deschise, folosind exemplul ztz240 și YG002. Activatorii umple spațiul dintre R207 și R210. Liniile întrerupte indică interacțiunile dintre activatori și R210. (B) Desenul arată cum acționează un ligand chimic pe calea de încărcare a porții, aflându-se în calea de încărcare a porții și împiedicând arginina să se deplaseze în starea sa descendentă.

---