DISERTATURA pentru obținerea unui doctorat în secția de chimie

1 Determinarea produselor de radioliză a aminoacizilor orto-tirozină și acid 3- (4-hidroxifenil) propionic ca dovadă a iradierii γ a alimentelor bogate în proteine DISERTATURA pentru obținerea titlului de doctor în cadrul Departamentului de Chimie al Universității din Hamburg de la Institutul de Biochimie și Chimia Alimentelor - Departamentul de Chimie a Alimentelor de la Universitatea din Hamburg prezentat de Jana Huňková de la Kladno Hamburg 23

2 Prezenta lucrare a fost realizată în perioada octombrie 1998 - 22 septembrie sub conducerea profesorului Dr. Dr. Hans Steinhart la Institutul de Biochimie și Chimia Alimentelor - Departamentul Chimia Alimentelor. Primul recenzor: Prof. Dr. Dr. Hans Steinhart Recenzor 2: Prof. Dr. Biscuit

3 Mulțumiri În acest moment aș dori să mulțumesc tuturor celor care m-au sprijinit în pregătirea acestei teze: Prof. Dr. Dr. Aș dori să-i mulțumesc lui Hans Steinhart pentru că a oferit subiectul și sprijinul excelent. Prof. Dr. Îi mulțumesc lui Bisping pentru preluarea prezentării. Dr. Aș dori să-i mulțumesc lui Thomas Simat pentru disponibilitatea sa constantă de a discuta și de cooperare, care au contribuit la succesul acestei lucrări. Aș dori să mulțumesc tuturor colegilor din Departamentul de chimie alimentară de la Universitatea din Hamburg pentru buna lor cooperare. Aș dori să mulțumesc companiilor Beiersdorf AG și GAMMASTER GmbH pentru iradierea probelor. Mulțumesc Daimler-Benz și Fundației H. Wilhelm Schaumann pentru sprijinul financiar al acestei lucrări. Le mulțumesc părinților mei pentru răbdarea lor inepuizabilă. Aș dori să mulțumesc prietenilor mei Ruth, Jiří, Robert, Britta, Astrid, Kerstin, Lui și Marijana pentru corectarea muncii și a altor asistențe diverse.

4 Lista abrevierilor 4 Lista abrevierilor 3,2-HPPA 3,3-HPPA 3,4-HPPA λ Ex λ Em AP-ESI BgVV CV Em ESR EU Ex FAO FIA FL FLD GC HCl HPLC IAEA IS kgy LMBG M m/z MeCN MeOH min MS MSD MW n Acid 3- (2-hidroxifenil) -propionic Acid 3- (3-hidroxifenil) -propionic Acid 3- (4-hidroxifenil) -propionic Lungime de undă de excitație Lungime de undă de emisie Presiune atmosferică Electrospray Ionizare Institutul Federal pentru Protecția Sănătății Consumatorilor și Medicină Veterinară Variante Coeficient de variație și Agricultură Organizație Analiza injecției de flux Fluorescență Fluorescență Detecție Cromatografie gazoasă Acid clorhidric Cromatografie lichidă de înaltă performanță Agenția internațională pentru energie atomică Standard intern Kilo Grey Legea alimentelor și mărfurilor Raport de masă moleculară Masă la încărcare Acetonitril Metanol Minute Spectrometrie de masă Detecție selectivă de masă

5 Lista abrevierilor 5 n.n. n.b. NH 4 acetat NH 4 formiat NWG PE Phe RP RT SIM SPE TFA TL Tyr UV v/v OMS WFR nedetectabil nedeterminat acetat de amoniu limită de detecție a formatului de amoniu polietilen fenilalanină fază inversă temperatura camerei monitorizare cu un singur ion extracție fază solidă acid trifluoroacetic termoluminescență tirozină raport de volum ultraviolete

6 Cuprins 6 Cuprins 1 INTRODUCERE OBIECTIV PRINCIPII TEORETICE Iradierea alimentelor Efecte chimice ale radiației ionizante Efectul primar al iradierii Efectul secundar al iradierii Influența dozei de iradiere Influența ratei dozei Influența temperaturii în timpul iradierii Schimbarea alimentelor în timpul înghețării DEZVOLTAREA METODELOR DE DETERMINARE A O-TIROZINEI Optimizarea condițiilor cromatografice Optimizarea detecției Detectarea fluorescenței (FLD) Detectarea selectivă a masei (MSD) Dezvoltarea unei curățări Deproteinizarea Omogenizarea Izolarea o-tirului prin extracția în fază solidă -HIDROXIFENIL) -ACID PROPIONIC Optimizarea condițiilor cromatografice. 43

7 Cuprins Optimizarea detectării Dezvoltarea unei curățări Deproteinizare Izolarea și îmbogățirea acidului 3- (4-hidroxifenil) propionic prin extracție lichid-lichid Izolarea și îmbogățirea acidului 3- (4-hidroxifenil) propionic prin extracție în fază solidă Validare Discuție DETERMINAREA FENILALANINEI ȘI P-TIROZINĂ ÎN ALIMENTELE BUTE ÎN PROTEINE DETERMINAREA O-TIROZINEI ÎN ALIMENTELE RICHE ÎN PROTEINE Influența temperaturii Determinarea o-tirozinei la alimente bogate în proteine iradiate RT de iradiere - conținutul de fundal al glazurii de o-tirozină în eșantioane neradiate Relația dintre conținutul de fenilalanină și formarea indusă de radiații de o-tirozină DETERMINAREA ACIDULUI 3- (4-HIDROXIFENIL) -PROPIONIC ÎN ALIMENTELE PROTEINE-RIC-iradiate cu γ conținutul de p-tirozină și formarea indusă de radiații a acidului 3- (4-hidroxifenil) propionic REZUMAT DE DISCUȚIE - REZUMAT Rezumat Rezumat LITERATURĂ. 82

9 Cuprins Schimbătoare de anioni Validarea procesului pentru determinarea acidului 3- (4-hidroxifenil) propionic Determinarea acidului 3- (4-hidroxifenil) propionic în alimentele bogate în proteine iradiate cu γ Rezultate ale iradierii γ a alimentelor Determinarea 3- (4-hidroxifenil) - cromatograme de acid propionic. 125

14 1 Introducere 14 reacționează aceleași produse de oxidare. Noua abordare pentru identificarea alimentelor bogate în proteine iradiate cu γ și în același timp cu alimente cu conținut scăzut de grăsimi oferă o determinare a noului potențial marker de radiație 3,4-HPPA. Pe baza unui screening, KLEEBERG (22) a descoperit acest produs de radioliză a aminoacizilor în diverse alimente bogate în proteine iradiate cu γ, cum ar fi creveții din Marea Nordului, pieptul de pui și alte tipuri de creveți. Acest marker de radiație a fost detectabil atât la temperatura camerei, cât și în alimentele iradiate congelate. S-au găsit diferențe semnificative între nivelurile de 3,4-HPPA în probele neiradiate și iradiate. 3,4-HPPA a fost determinat utilizând HPLC/FLD. Această procedură nu a putut fi utilizată încă ca o procedură de rutină.

16 3 Bazele teoretice 16 3 Bazele teoretice 3.1 Iradierea alimentelor Trei tipuri diferite de radiații sunt permise pentru iradierea produselor alimentare (CODEX ALIMENTARIUS, 1984): razele γ ale radionuclizilor 6 Co (sunt produse artificial din 59 Co, două γ-cuante sunt, de asemenea, emise cu o energie de 1,17 MeV și 1,33 MeV) razele γ ale radionuclizilor 137 Cs (din fisiunea nucleară, se emite o γ-cuantă cu o energie relativ scăzută de .66 MeV) raze β până la o energie de Razele X 1 MeV (radiații secundare de la acceleratorul de electroni) până la o energie de 5 MeV. Pentru iradierea alimentelor, razele γ sunt cele mai des utilizate, deoarece au o capacitate mare de penetrare a materiei în comparație cu razele β și, prin urmare, sunt potrivite pentru iradierea produselor de pe paleți (DIEHL, 1995). În funcție de zona de aplicare a radiației, se utilizează doze diferite de radiații cuprinse între 0,5 și 1 kgy. Intervalul de doze mari de peste 1 kgy nu este aprobat pentru produsele alimentare comerciale, dar este utilizat în scopuri speciale pentru sterilizare. Unele domenii de aplicare cu dozele maxime admise de radiații sunt enumerate în Tabelul 2 (AIEA, 2).

18 3 Baza teoretică 18 divizată radiolitic, cu următoarele produse de radioliză care apar în esență (ec. 4) (DRAGNIC și DRAGNIC, 1963, VON SONNTAG, 1987, DODD, 1995): H 2 O OH + e - aq + H + H 3 O + (Ec. 4) Efectul secundar al radiației Radicalii liberi formați de efectul primar al radiației ionizante sunt foarte reactivi și pot reacționa între ei sau cu ingredientele alimentare, ceea ce duce la produsele secundare ale radiației. Speciile rezultate pot reacționa în continuare după cum urmează (ecuația 5, 6, 7): combinație R + H RH (ecuația 5) dimerizarea R + R RR (ecuația 6) RH + + e - captare electronică RH aq (ecuația 7 ) Radicalii hidroxil ca produse primare de radioliză a apei au un efect oxidativ puternic. Aceștia sunt deosebit de reactivi față de compușii nesaturați și cei cu inele aromatice (KARAM și SIMIC, 1989, WANG și colab., 1993). Când un radical OH atacă Phe, are loc adăugarea la inelul aromatic, formându-se patru posibili intermediari (Figura 1). Trei dintre ele (1, 2, 3) duc la formarea hidroxi-Phe, în timp ce forma Ipso (4) duce la produse necunoscute (WANG și colab., 1993). Figura 1: Formarea radicalilor hidroxi-Phe prin efecte primare și secundare

23 3 Bazele teoretice 23 Normalizarea funcțiilor digestive în (GUTSCHMIDT, 1964). Acizi grași liberi enzimatic sunt eliberați din lipide. Formarea lor este dependentă de temperatură și mai lentă la temperaturi mai scăzute decât la temperaturi mai ridicate. De obicei, enzimele nu sunt distruse de procesul de îngheț. Ele pot fi complet active din nou când temperatura crește. Enzime de deteriorare a grăsimilor, de ex. Lipazele și lipoxidazele sunt încă active chiar și la temperaturi scăzute și conduc la formarea de produse de descompunere a grăsimilor (aldehide, cetone, acizi, peroxizi) și la descompunerea fosfatidelor (HERRMANN, 197).

31 5 Dezvoltarea metodelor pentru determinarea o-tirozinei 31 3 Excitație lungime de undă (nm) valoare maximă maximă a pH-ului Figura 5: Influența valorii ph asupra excitației și emisiilor maxime Optimizarea intensității fluorescenței Proprietățile fluorescente ale izomerilor Tyr sunt dependente de valoarea ph . Din acest motiv, a fost investigată influența valorii pH-ului tamponului asupra intensității fluorescenței tirului o și, de asemenea, asupra sensibilității detecției. În acest scop, soluțiile o-tyr din tamponul fosfat cu valori ale pH-ului cuprinse între 1,5 și 9,3 au fost măsurate fluorimetric (λex = 275 nm, λem = 35 nm). S-a constatat că intensitatea fluorescenței atinge valoarea maximă în domeniul pH-ului de 4-5 (Figura 6). Valoarea ph a intensității fluorescenței (%) Figura 6: Dependența intensității fluorescenței o-tirului de valoarea ph Următoarea procedură a fost utilizată pentru a transfera rezultatele obținute cu tampon fosfat în fazele mobile testate. O soluție o-tyr în cea dezvoltată de HEIN și colab. (2) eluant utilizat, 1% TFA (pH 1,8) a fost, de asemenea, măsurat fluorimetric (λex = 275 nm, λem = 35 nm). O-tirul a fost, de asemenea, investigat într-o soluție de 0,5 m/l NH4format la pH 3, 4 și 4,5. Intensitatea maximă a fluorescenței a fost obținută cu o soluție o-tyr în tampon NH4format la pH 4