Efectul restricției calorice asupra permeabilității intestinale, a markerilor inflamatori și a fecalelor

subiecte

abstract

introducere

Pe baza observației că obezitatea este legată de o afecțiune cronică, extrem de inflamatorie și, eventual, de permeabilitate intestinală 7, studiul de față a urmărit să investigheze dacă restricția calorică poate modula permeabilitatea intestinală și, prin urmare, să scadă markerii inflamației la om. În plus, au fost cercetate diversitatea și compoziția microbiotei intestinale, precum și posibila lor legătură cu permeabilitatea și inflamația intestinală.

Rezultate

Dieta redusă cu formulă calorică a dus la pierderea în greutate

Douăzeci de femei (vârste medii 46, 8 ± 11, 5) au fost înscrise în studiu și niciun participant nu a renunțat. Caracteristicile fizice și biochimice ale participanților înainte de intervenție, imediat după dieta hipocalorică și 14 zile după intervenție sunt prezentate în Tabelul 1. Participanții au fost rugați să ia o dietă (800 kcal/zi) și încă 200 g de legume. Comparativ cu aportul original de calorii de 1.698, 1 ± 592, 7 kcal/zi, această intervenție a provocat un deficit energetic considerabil (P 23, 24, a arătat o scădere semnificativă după restricția calorică (P 25. Concentrația plasmatică la începutul studiului a crescut semnificativ după o intervenție hipocalorică de 4 săptămâni din (P

( A - d ) Completați graficele pe baza valorilor pragului ciclului (CT) ale biopsiilor de țesut adipos de la 18 participanți înainte și după restricția de calorii de 4 săptămâni. ( e ) Pentru diametrele celulelor adipoase, datele au fost disponibile de la 8 participanți. *** P 2 și a scăzut la 4.020 ± 773 μm 2 (n = 8, P = 0.31).

Intervențiile au declanșat modificări individuale în profilurile microbiotei din scaun

restricției

Pentru a distinge între reducerea caloriilor și pierderea în greutate, am examinat participanții după ce ne-am întors la o dietă echilibrată de menținere a greutății timp de două săptămâni consecutive. Datele sugerează că majoritatea modificărilor observate la dieta hipocalorică au dispărut, sugerând că aceste modificări se datorează în principal restricției calorii acute și profunde, mai degrabă decât scăderii moderate a greutății corporale experimentate de participanți nu a câștigat greutate semnificativă în timpul celor două săptămâni de urmărire.

Așa cum era de așteptat, concentrațiile plasmatice ale markerului inflamator hsCRP au scăzut după VLCD, ceea ce este în concordanță cu literatura 28. Am măsurat, de asemenea, LBP circulant ca un marker surogat pentru translocarea componentelor peretelui celular de la bacterii Gram-negative, un termen cunoscut sub numele de endotoxemie asociată cu intestinul 9. Reducerea caloriilor a dus la o scădere destul de modestă a nivelului LPB 29, care este în acord cu rezultatele măsurătorilor permeabilității intestinale și cu scăderea posibilă asociată a markerilor inflamatori. Cu toate acestea, proiectarea studiului nu permite să se tragă concluzii clare despre posibila relație cauzală dintre translocația endotoxinei și inflamația sistemică.

Nivelurile de leptină plasmatică au scăzut semnificativ, în timp ce adiponectina HMW a crescut după intervenție. În schimb, nivelurile MCP-1 au rămas neschimbate. O explicație ar putea fi că o pierdere medie în greutate de 7% este prea mică pentru a avea un efect mai mare asupra markerilor de inflamație legați de obezitate 30. În plus, modificările expresiei genetice pentru markeri selectați în țesutul adipos - cu excepția leptinei - s-au datorat probabil pierderii în greutate limitate. În ciuda reducerii semnificative a greutății, nu s-a observat nicio scădere semnificativă a dimensiunii celulelor grase ale țesutului adipos subcutanat din abdomen. Cu toate acestea, există o tendință către o scădere a dimensiunii medii a adipocitelor. Verhoef și colab. a arătat că o scădere în greutate de 10% a mediat o scădere semnificativă a mărimii adipocitelor 31 .

Intervenția a fost, de asemenea, asociată cu o incidență crescută a câte un OTU în genul Ruminococcus și Bifidobacterium, care a inclus atât produse de degradare a alimentelor din polizaharide complexe, cât și polizaharide derivate din gazdă 40. Santacruz și colab. a arătat, de asemenea, o creștere a numărului qPCR de Bifidobacterium spp. după pierderea în greutate (-6,9 kg) la adolescenții obezi după 10 săptămâni de reducere a caloriilor 41 .

Punctul forte al studiului nostru constă în standardizarea strictă și fenotiparea cuprinzătoare a participanților. În plus, a fost utilizată o gamă largă de metode diferite pentru a caracteriza influența VLCD asupra permeabilității intestinale: starea metabolică a fost evaluată cu oGTT; Starea inflamatorie a fost examinată utilizând diverși parametri circulanți și expresia genelor în probe de țesut adipos. Rezultatele au fost susținute în continuare de date referitoare la microbiota intestinală, care au urmat un model individual. Sunt necesare studii suplimentare pentru a înțelege mai bine aceste răspunsuri eterogene.

În concluzie, datele noastre sugerează că o dietă VLCD de 4 săptămâni are efecte benefice asupra funcției de barieră intestinală la femeile obeze, care dispare rapid după revenirea la o dietă normală. Posibila relație de cauzalitate între modificările permeabilității intestinale și modificările observate la biomarkerii metabolici și inflamatori, precum și la anumite bacterii țintă, necesită investigații suplimentare.

Participanți și metode

Protocolul de studiu a fost verificat și aprobat de comitetul de etică al Facultății de Medicină a Universității Tehnice din München (aprobare nr. 5499/12). Studiul s-a bazat pe liniile directoare ale Conferinței internaționale privind armonizarea bunelor practici clinice și Declarația de la Helsinki (în versiunea revizuită de la Seul, Coreea de Sud 2008). Consimțământul informat scris a fost obținut de la toți participanții înainte de includerea în studiu. Studiul a fost înscris în registrul de testare german (DRKS00006210). Data de înregistrare pentru registrul de testare german a fost 11 iunie 2014.

Participanții la studiu

Douăzeci de participanți cu un IMC ≥ 30 kg/m² au fost recrutați în octombrie 2013 prin reclame în zona München. Eligibilitatea de a participa a fost evaluată folosind un chestionar detaliat de screening cu detalii despre istoricul medical. Criteriile de excludere au fost: IMC

efectul

Design de studiu. Schema oferă o prezentare generală a programului și a diferitelor examinări efectuate. Abrevieri: BS, probă de sânge; FB, biopsie de grăsime; FS, proba de scaun; GP, permeabilitate intestinală; IC, calorimetrie indirectă; RMN, imagistica prin rezonanță magnetică; NC, Sfaturi nutriționale; PE, examen fizic; oGTT, test oral de toleranță la glucoză; chestionar.

Protocoale dietetice

Participanții la studiu au fost instruiți să-și înregistreze consumul de alimente pe toată durata studiului. Conținutul de energie și compoziția macronutrienților din diete au fost calculate utilizând software-ul OptiDiet Plus (versiunea 5.1.2.046, GOE mbH, Linden, Germania).

Măsurători antropometrice

Măsurătorile antropometrice și clinice au fost standardizate între 8 a.m. și 9 a.m. după un post peste noapte. Greutatea corporală și compoziția au fost măsurate folosind TANITA Body Composition Analyzer Type BC-418 MA III (Amsterdam, Olanda). Rata metabolică de repaus (RMR) a fost măsurată folosind un baldachin (COSMED Quark RMR, Fridolfing, Germania).

Probele de sânge și analiza biochimică

Probele de sânge au fost prelevate în timpul postului. Parametrii lipidici (colesterol total, LDL-c, HDL-c, trigliceride), enzime hepatice (aspartat transaminază (AST), alanină transaminază (ALT), γ-glutamiltransferază (γ-GT)), creatinină, acid uric și glucoză la jeun au fost determinați de SynLab (München, Germania) analizate. O probă de sânge suplimentară a fost colectată, centrifugată imediat (2.500 g timp de 10 minute la 20 ° C) și apoi stocată la -80 ° C până la analiză. Leptina, Chemerin, hsCRP, RANTES, MCP-1, HMW-Adiponektin și LBP (toate: R&D, Wiesbaden, Germania), insulina (Dako, Glostrup, Danemarca) și zonulina (Immundiagnostik AG, Bensheim, Germania) erau în plasmă examinate folosind teste imunosorbente legate de enzime disponibile în comerț (ELISA). Calprotectina fecală a fost măsurată cu ajutorul ELISA (CALPROLAB ™ Calprotectin ELISA (HRP), FROST Diagnostika GmbH, Otterstadt, Germania). Toate ELISA au fost efectuate conform descrierii producătorilor. NEFA au fost măsurate folosind un kit de testare comercial (Wako Chemicals GmbH, Neuss, Germania). Rezistența la insulină a fost estimată utilizând HOMA-IR [HOMA-IR = insulină (μU/ml) × glucoză (mmol/l)/22, 5] 42.

Test de toleranță orală la glucoză

Testele orale de toleranță la glucoză (OGTT) au început între 8 și 9 dimineața, după un post peste noapte de 12 ore. După prelevarea unei probe de sânge de bază, subiecții au primit 75 g de glucoză într-un volum de 300 ml (AccuCheck®-OGT, Roche, Mannheim, Germania). După 30, 60 și 120 de minute, s-a extras sânge și s-a determinat nivelul de glucoză (HemoCue Glucose 201 +, calibrat cu plasmă, Ängelholm, Suedia).

Permeabilitatea intestinală

Funcția intestinală obstructivă a fost evaluată folosind diferite teste neinvazive. În primul rând, permeabilitatea intestinală a fost măsurată utilizând un test validat de absorbție a zahărului și un test cu PEG. Ambele teste au fost efectuate în paralel. Principiul este de a măsura excreția urinară a substanțelor administrate oral cu diferite mase moleculare. Testele au fost efectuate chiar înainte de procedură, după procedură și la două săptămâni după procedură. Datele sunt prezentate ca procentul de zahăr ingerat și procentul de PEG găsite în urină. Aceste valori sunt denumite% recuperare urină. În cele din urmă, zonulina markerului de permeabilitate intestinală a fost măsurată în sânge utilizând ELISA.

Test de absorbție a zahărului

Testul de absorbție a zahărului a fost efectuat așa cum este descris de Norman și colab. 43. Zaharurile au fost cuantificate prin cromatografie lichidă de înaltă performanță cu detecție electrochimică pulsată (modul de cromatografie: 250, Dionex, Idstein, Germania) 43.

Test de absorbție a polietilenglicolului

Participanții au primit 100 ml dintr-o soluție de test PEG cu 1 mg greutate moleculară (Mr) 400 (PEG 6-PEG 13; interval de masă: 285-678 Da), 200 mg Mr 1500 (PEG 20 -PEG 45; masă) interval: 899-2,000 Da), 4 g Mr 3000 (PEG 51 -PEG 90; interval de masă: 2,264-3,982 Da) și 4 g Mr 4000 (PEG 75 -PEG 115: interval de masă: 3,322-5,084 Da) (Merck Darmstadt, Germania). La cinci ore după ingestia soluției de testare a zahărului, soluția de testare PEG a fost băută și au fost prelevate probe de urină în următoarele 24 de ore. PEG-urile au fost analizate prin cromatografie lichidă-spectrometrie de masă așa cum este descris de Lichtenegger și Rychlik 44 .

Biopsie de țesut adipos subcutanat abdominal

Probele de țesut adipos subcutanat abdominal au fost obținute prin aspirarea acului înainte și după dieta prescrisă. După spălare în tampon Krebs-Ringer, țesutul adipos a fost împărțit în tuburi care conțin margele de sticlă zirconia sterilizate (Carl Roth, Karlsruhe, Germania), tampon RLT (RNeasy Mini Kit, Qiagen, Hilden, Germania) și 1% (v/v ) β-mercaptoetanol (# M3148, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, SUA) și apoi imediat înghețat și depozitat la -80 ° C. Pentru histologia grăsimilor, țesutul adipos a fost fixat în 4% formalină tamponată (pH 7,4) timp de 24 de ore și în cele din urmă încorporat în parafină și depozitat la temperatura camerei până la analiză. Mărimea adipocitelor a fost determinată folosind software-ul open source de analiză a imaginii cellprofiler® (http://www.cellprofiler.org/).

Reacție în lanț cantitativă a polimerazei

Probele de scaun

Probele de scaun au fost colectate direct în recipiente de plastic sterile (1000 ml; VWR International, München, Germania). Participanții au fost rugați apoi să colecteze o lingură de plastic la un punct al materialului fecal într-un tub de colectare a scaunului cu 8 ml de tampon de stabilizare a ADN-ului (Stratec Molecular GmbH, Berlin, Germania). Probele de scaun au fost apoi imediat congelate la -18 ° C până la următoarea vizită. Participanții au transportat probele de scaun congelate la laborator folosind unități de răcire. În cele din urmă, tuburile de colectare au fost stocate imediat la -80 ° C.

16 Secvențierea ampliconului genei ARN S-ribozomal cu randament ridicat

Probele au fost prelucrate conform descrierii anterioare 48. Pe scurt, celulele au fost lizate prin margele și tratament termic și ADN-ul metagenomic a fost purificat folosind coloane de ADNc (Macherey-Nagel, Düren, Germania). Concentrațiile și puritatea au fost verificate folosind sistemul NanoDrop® (Thermo Scientific Waltham, Massachusetts, SUA). Regiunea V3/V4 a 16 gene de ARN S-ribozomal (rRNA) a fost amplificată din 24 ng de ADN folosind primerii 341 F și 785 R 49 (25 cicluri). După purificare (sistemul AMPure XP, Beckmann Coulter Biomedical GmbH) și gruparea în cantități echimolare, cei 16 ampliconi ai genei S-rRNA s-au aflat în modul pereche (PE275) folosind un sistem MiSeq (Illumina, Inc., San Diego, California, SUA) secvențiat. SUA) conform instrucțiunilor producătorului și o concentrație finală de ADN de 10 pM și 15% (v/v) biblioteca standard PhiX.

Analiza secvenței

Fișierele citite brute au fost procesate pe baza abordării UPARSE 50 folosind IMNGS 51. Secvențele au fost testate pentru prezența himerelor folosind UCHIME 52 și OTU-urile au fost grupate la un prag de 97% similaritate de secvență. Pentru a evita analiza OTU-urilor incorecte, doar cele cu o frecvență relativă de> 0,5% secvențe totale au fost stocate în cel puțin un eșantion. SILVA (SILVA Incremental Aligner Version 1.2.11) 53 și clasificatorul RDP (propoziția 15; 80% certitudine) 54 au fost utilizate pentru a atribui o clasificare taxonomică secvențelor reprezentative ale OTU. OTU-uri specifice cu frecvențe diferite între grupuri au fost identificate în continuare cu EzTaxon. Relațiile filogenetice au fost examinate folosind Metoda UniFrac Generalizată 55. Numărul efectiv Shannon a fost utilizat pentru a estima diversitatea intra-eșantion (diversitatea alfa) așa cum este descris de Jost și colab. 56 .

analize statistice

Datele au fost analizate în mediul de programare R. Datele antropometrice și metabolice sunt prezentate ca medie ± deviație standard. Valorile P 57 utilizate. Efectul VLCD asupra OTU-urilor și recensămintelor taxonomice a fost testat folosind testul Friedman Rank pentru a analiza un design al blocului randomizat nonparametric. Valorile lipsă au fost tratate cu testul Skillings Mack. Testul sumei de rang semnat Wilcoxon pentru perechi potrivite a fost utilizat pentru comparații în perechi. Metoda Benjamini-Hochberg a fost utilizată pentru ajustare după mai multe teste. Pentru analiza diversității beta, distanțele generalizate UniFrac au fost calculate cu pachetul GUniFrac 55.

mulțumire

Mulțumim Dr. Claudia Eichhorn pentru realizarea aspirației acului, Julius Honecker pentru sprijinul excelent în măsurarea dimensiunii celulelor grase, Dr. Karin Norman pentru sprijinul său în măsurarea permeabilității intestinale, Manuela Hubersberger pentru suportul tehnic excelent și Caroline Ziegler în rolul Angela Sachsenhauser de la ZIEL Core Facility Microbiome/NGS pentru sprijinul său excelent în pregătirea probelor pentru secvențierea de mare randament Acest studiu a fost finanțat de BMBF (Ministerul Federal al Educației și Cercetării, subvenția nr. 0315674). Dieta cu rețete a fost oferită cu amabilitate de Nutrition Santé SAS (Revel, Franța).

Material electronic suplimentar

Dosar suplimentar

Observații

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord cu termenii noștri de utilizare și cu regulile comunității. Dacă găsiți ceva abuziv sau care nu respectă termenii sau liniile directoare, marcați-l ca fiind inadecvat.