Funcționalizarea suprafeței nanoparticulelor pentru interacțiunea țintită cu biomoleculele - PDF
1 Funcționalizarea la suprafață a nanoparticulelor pentru interacțiunea țintită cu biomoleculele Disertație pentru obținerea diplomei academice de Doctor în Științe ale naturii (Dr. rer. Nat.) Trimisă în Departamentul de Biologie, Chimie, Farmacie al Universității Libere din Berlin prezentată de Dipl.-Chem. Meike Roskamp din Papenburg ianuarie 2010
2 1 recenzor: Prof. Dr. Sabine Schlecht Recenzorul 2: Prof. Dr. Contestație Hans-Ulrich Reissig pe
4 Dr. Aș dori să îi mulțumesc lui Jens Dernedde pentru colaborarea plăcută în investigarea nanoparticulelor care leagă selectina și a investigațiilor privind toxicitatea nanoparticulelor. Aș dori să îi mulțumesc Ilonei Papp pentru o bună cooperare și marea sa disponibilitate de a ajuta. Aș dori, de asemenea, să mulțumesc tuturor departamentelor de servicii ale Institutului pentru Chimie și Biochimie, în special Dr. Johann Spandl pentru familiarizarea cu spectrometrul IR și Rita Friese pentru realizarea TGA. Aș dori să-i mulțumesc lui Michael Stasiak pentru corectura acestei lucrări și pentru sprijinul său moral pe parcursul scrierii. Aș dori să mulțumesc elevilor Nelly Rivas, Franziska Buchner, Kathera Hazin, Mareike Noah și Christina Lüders pentru sprijinul lor sintetic. Aș dori să îi mulțumesc celei mai bune prietene a mele Annette Brunsen pentru sprijinul pe care l-a oferit întotdeauna, în ciuda distanței mari și a influenței sale pozitive asupra abilităților mele organizaționale. Le mulțumesc părinților mei pentru sprijinul pe care l-am putut baza întotdeauna. Aș dori să mulțumesc lui Fritz Wilhelm Wernicke pentru înfrumusețarea răcitorului de reflux, micile note de pe biroul meu și tururile orașului, pentru sprijinul și răbdarea sa.
5 Cuprins Cuprins 1 Motivație 7 2 Introducere în zona de lucru Sinteza și caracterizarea nanoparticulelor Sinteza nanoparticulelor Caracterizarea nanoparticulelor Funcționalizarea suprafeței nanoparticulelor Reacții de schimb ale ligandilor Reacții la periferia ligandului Adsorbția moleculelor pe coaja ligandului Combinație a mai multor metode de funcționalizare a suprafeței Arhitecturi multi-dimensionale de nanoparticule Toxicitate Prezentare generală a ariei medicale acoperite 40 3 Rezultate și discuții Sinteza nanoparticulelor Sinteza și caracterizarea coloizilor Au Sinteza și caracterizarea coloizilor Ag Sinteza și caracterizarea coloizilor Au/Ag-Aliaj Sinteza și caracterizarea coloizilor CdS Indus de peptide Agregarea nanoparticulelor Structura și proprietățile peptidelor utilizate Nanoparticulele încărcate ca elemente de bază pentru aranjamentul electrostatic Managementul și stabilitatea nanoparticulelor în tampon Aranjamentul indus de VW05 al NP-urilor încărcate negativ Formarea fibrilelor induse de nanoparticule Nanoparticulele care leagă selectina 109 5
6 Cuprins Dependența inhibiției de gradul de sulfatare Reproductibilitatea valorilor IC 50 Influența structurii ligandului de legare Influența legăturii peptidice Influența lungimii lanțului Influența dimensiunii nanoparticulelor Compararea influenței factorilor examinați asupra valorii IC 50 Studii TEM Toxicitatea celulară a NP Imobilizarea NP în NP Fibrele polimerice Rezumatul și perspectivele Rezumatul Partea experimentală Abrevieri Solvenți și reactivi Sinteze Sinteze NP Reacții de schimb de ligand Modificare covalentă a sintezei NP a liganzilor Dispozitive și metode de măsurare utilizate Dializă Electroforeză pe gel Spectrometru RMN Spectrometru IR Analiză termogravimetrică (TGA) Microscop electronic de transmisie (TEM) UV/Vis- Spectrometru Analiză obligatorie bazată pe SPR competitivă Bibliografie Anexa 216 6
23 2 Introducere în zona de lucru Figura 2.7: Producerea nanoparticulelor Au coordonate cu lipază utilizând chimia clicurilor [77]. Thode și Williams au efectuat un studiu al cineticii cicloadiției 1,3-dipolare între azidă și alchin pe suprafața NP-urilor de aur (schema a se vedea figura 2.8) [79]. În plus față de solvent, substituenții de pe cetona alchină, lungimea lanțului linkerului, adică. H. partea de legătură a moleculei, între grupul azidic și suprafața NP și densitatea grupelor azidice de pe suprafața particulelor. O comparație cuprinzătoare între reacția în soluție și pe o suprafață a particulelor nu a fost efectuată, dar ratele de conversie par a fi foarte similare [80]. Interesant este că o modificare a densității de ocupare a grupurilor funcționale de pe suprafața particulelor a avut un efect mai mare asupra randamentului obținut decât oricare alt parametru examinat în acest studiu. Figura 2.8: Schema generală pentru formarea triazolului pe NP aurii [79]. 23
45 2 Introducere în domeniul nanoparticulelor de aur glicoconjugate [153, 157] și nanoparticulelor de sulfură de cadmiu [158] și examinate pentru proprietățile lor anti-adezive sau, în cazul nanoparticulelor semiconductoare, adecvarea lor pentru marcarea celulelor. Scopul acestui grup de lucru este o mai bună înțelegere a interacțiunilor carbohidrați-carbohidrați [159], dar și influența proceselor de adeziune celulă-celulă mediate de carbohidrați, cum ar fi procesul inflamator. Particulele de polimer pot servi și ca purtători pentru mono- și ligozaharide. Haag și colab. a arătat în 2008 că particulele de poliglicerol funcționalizate cu galactoză sunt capabile să inhibe legarea selectinei [160]. În plus față de dependența de gradul de funcționalizare a particulelor, s-a găsit în această lucrare o îmbunătățire clară a proprietăților de legare după sulfarea reziduurilor de galactoză. Această observație coincide cu lucrarea lui Linhardt și colab. observații făcute pentru heparină (vezi mai sus). 45
67 []/(10 3 degcm 2 dmol -1 reziduu -1) 3 Rezultate și discuții VW19 RR/nm Figura 3.25: Spectre CD de 50 µm VW19 și 50 µm RR01 la pH 7,4. O descriere mai detaliată a structurilor VW19 și RR01 în funcție de concentrație și valoarea ph poate fi găsită în publicațiile de Pagel și colab. poate fi preluat din [182, 183]. Tabelul 3.5 arată sarcina netă calculată a peptidelor în funcție de valoarea ph. VW19 este încărcat pozitiv sub pH 10 și încărcat negativ deasupra acestuia. RR01 este deja încărcat negativ de la aproximativ Ph 5. În timp ce VW19 are o sarcină netă pozitivă în soluțiile neutre și, prin urmare, va intra în interacțiuni electrostatice atractive cu NP-uri încărcate negativ, RR01 are o sarcină netă negativă în acest interval de pH, ceea ce sugerează interacțiuni electrostatice repulsive cu NP-uri încărcate negativ. Opusul este adevărat pentru NP-uri încărcate pozitiv. Cu RR01, interacțiunile electrostatice atractive apar în acest interval de valori ph, în timp ce interacțiunile electrostatice repulsive sunt de așteptat cu VW19. Tabelul 3.5: Încărcarea netă a peptidelor VW19 și RR01 la valori de pH diferite [179]. valori ph sarcină netă VW19 [e/peptidă] sarcină netă RR01 [e/peptidă]
88 3 Rezultate și discuții Figura 3.43: imagini TEM din coordonate MUDS. Au-NP (d = 6 nm) la pH 9 în 10 mm tampon Tris/HCI (a) fără și (b, c și d) cu 10 µm VW05. În timp ce PN-urile fără peptidă au fost izolate și distribuite relativ uniform pe grila TEM, o agregare clară a particulelor a putut fi văzută în prezența a 10 µm VW05. În plus față de agregatele peptidei NP cu o dimensiune de 100 nm, unele NP situate individual pot fi găsite și la această concentrație și preparare a peptidei. În comparație cu imaginile TEM din testele preliminare (Figura 3.40), structura agregatelor pare să aibă o anumită ordine pe termen scurt în locuri (vezi Figura 3.43 d), dar nu există o ordine pe termen lung a particulelor, în ciuda dispersiei semnificativ îmbunătățite a particulelor. Uscarea eșantionului în timpul pregătirii rețelei poate duce la efecte de agregare care nu apar în soluție. Eșantioanele pregătite în acest mod permit deci să se tragă concluzii limitate despre situația 88 în ceea ce privește starea de agregare a componentelor
89 3 Rezultate și discuții în soluție. Îndepărtarea solventului poate duce, de asemenea, la prăbușirea structurilor ordonate dacă, așa cum se știe din agregatele NP-ADN [104], un procent ridicat din structură este ocupat de molecule de solvent. Astfel, gradul de ordine al agregatelor peptidice NP în soluție nu trebuie neapărat să corespundă cu cel de pe imaginile TEM pregătite în acest mod. Înregistrările Cryo-TEM au avantajul că proba nu este uscată, ci înghețată, astfel încât proba este într-o stare comparabilă cu soluția în ceea ce privește distanțele dintre componentele prezente în timpul măsurării. Imaginile crio-TEM ale coordonatorului MUDS. Au-NP și VW05 la pH 9 sunt prezentate în Figura 3.44 și oferă în esență aceleași rezultate în ceea ce privește comportamentul de agregare al PN și gradul lor de ordine în agregate, așa cum se arată în Figura 3.43. Figura 3.44: Imagini Cryo-TEM de 0,05 µm MUDS coord. Au-NP (d = 6 nm) la ph 9 și măriri diferite (a și b) fără VW05 și (c și d) cu 10 µm VW05. 89
Pentru a putea lucra la rezultate și discuții, ar fi necesară o schimbare a solventului. Încercările de a face acest lucru nu mai erau posibile în cadrul acestei lucrări. Figura 3.46: Imagini TEM ale unui amestec de 0,05 µm MUDS coord care a fost temperat la 80 C. Au-NP și 10 µm VW05. O altă observație interesantă a fost făcută la tratarea precipitatului cu ultrasunete. Soluția anterior violetă, tulbure, a devenit din nou limpede și roșie prin tratamentul cu ultrasunete. Fotografiile unei suspensii a agregatelor înainte și după tratamentul cu ultrasunete sunt prezentate în Figura 3.47. După un timp scurt (aprox. 10 min) precipitatul și culoarea violet s-au retras. Nu s-a clarificat încă dacă acest proces se datorează exclusiv mărunțirii mecanice a agregatelor sau unei modificări induse de ultrasunete în conformația peptidică. Figura 3.47: Fotografii ale unui amestec de 0,05 µm MUDS coord. Au-NP cu 10 µm VW05 (a) înainte și (b) după aproximativ 20 de secunde de tratament cu ultrasunete. 92
94 3 Rezultate și discuții h, 6 h, 20 h max/nm c (sr05)/M Figura 3.49: Absorbție maximă de 0,05 µm MUDS coord. Au-NP în funcție de concentrația SR05 la pH 9 (10 mm tampon Tris/HCI) direct după amestecarea componentelor și după 6 h și 20 h. Au existat interacțiuni electrostatice atractive între peptida SR05 încărcată pozitiv și NP-urile încărcate negativ, care au dus la o ușoară creștere a absorbției în spectrele de absorbție (vezi Figura 3.49 și spectrele din apendice, Secțiunea 8.1.5) și într-o ușoară creștere a electroforezei pe gel. Întârzierea benzilor NP cu creșterea concentrației de peptide (vezi Figura 3.50). Spre deosebire de experimentele cu VW05, totuși, nu s-a putut observa nicio formare de precipitat și nici o schimbare semnificativă a absorbției maxime. Figura 3.50: Electroforeză pe gel pe amestecuri de Au-NPs coordonate cu MUDS și SR05 la pH 9, în stânga sus: gel de agaroză expus la lumină albă, în stânga jos: gel de agaroză expus la 254 nm de lumină UV, dreapta: tabel cu raporturile de amestecare ale probelor aplicate. Poziția buzunarelor este marcată cu o linie roșie. 94
129 3 Rezultate și discuții NP11 a fost funcționalizat cu enantiomerul aminei imobilizate pe NP10 și apoi sulfatat. Valorile IC50 ale acestor doi coloizi (vezi Tabelul 3.10), atât pentru selectina L cât și pentru P, nu diferă semnificativ una de cealaltă. Enantiomerii au deci proprietăți de legare identice în acest exemplu. Tabelul 3.11 prezintă valorile IC50 ale altor doi coloizi funcționali aminopiran. NP12 și NP13 diferă în prezența unei grupări sulfat (marcate cu albastru în Tabelul 3.11). În timp ce NP12 prezintă trei grupe sulfat per ligand, ligandul NP13 are doar două cu o structură altfel identică. Tabelul 3.11: Valorile IC50 ale Au-NP sulfatate. Diametrul miezului Au NPs este de aproximativ 6 nm. Valorile marcate în verde au fost determinate cu un lot NP diferit, dar au fost ajustate matematic pentru acest tabel. Denumirea inhibitorului IC 50 L-selectin IC 50 P-selectin IC 50 E-selectin S3Na S 3Na Au S 9 N H NP pm 460 pm N.I. S3Na S 3Na Au S 9 N H NP pm 300 pm N.I. S 3 Na S3Na Au S 9 N H S3Na NP7 80 pm 130 pm N.I. 129
132 3 Rezultate și discuții Tabelul 3.13: Valorile IC50 ale Au NP sulfatate cu liganzi care poartă componente hidrofobe. Diametrul miezului Au-NP este de aproximativ 6 nm. Denumirea inhibitorului IC 50 L- selectin IC 50 P- selectin IC 50 E- selectin S 3Na S 3Na Au S 9 N H NP pm 130 pm N.I. S 3 Na NP pm 150 pm N.I. Au S 9 N H S 3Na S3Na Au S 9 N H S 3Na NP7 80 pm 130 pm N.I. Interesant este că coloizii Au coordonați cu MUDS (NP18) sunt, de asemenea, capabili să inhibe legarea L- și P-selectinei. Un dezavantaj al Au-NP-urilor coordonate cu MUDS este stabilitatea lor slabă de agregare la valori ale pH-ului mai mici de 9. Soluțiile de Au-NP-uri coordonate cu MUDS pot fi produse numai la concentrații foarte mici, dar acestea pot fi stocate doar pentru o perioadă scurtă de timp. Pentru experimentele prezentate aici, o soluție de 30 nmolar (pe baza concentrației de NP) a fost preparată și examinată în decurs de 24 de ore. Valorile IC 50 pentru coordonatele MUDS. PN-urile Au cu un diametru al miezului de aproximativ 6 nm sunt enumerate în Tabelul 3.14. Pentru comparație, valorile IC 50 ale NP7 și ale NP-urilor coordonate cu sulfat MUD (NP19) cu diametrul miezului de aproximativ 6 nm au fost, de asemenea, determinate aici. Sintezele NP18 și NP19 au fost deja prezentate în secțiune (schema pentru schimbul de liganzi vezi Figura 3.29). 132
134 3 Rezultate și discuții NP cu Au NP coordonate cu citrat, care prezintă și funcții carboxilate pe suprafața lor. În timp ce MUDS coord. Au-NP pentru L- și P-selectin IC 50 - valori din intervalul picomolar, nu au putut inhiba legarea selectinei în prezența coordonatului citrat. Au NP pot fi observate. Pe lângă substructura încărcată negativ, trebuie îndeplinite, prin urmare, alte cerințe pentru a obține o bună afinitate de legare. Nu este suficient să oferiți o particulă încărcată negativ într-un anumit interval de dimensiuni pentru lipire. Comportamentul de legare al coordonatului citratului. Au-NP indică deja că rezultatele măsurate nu se datorează interacțiunilor nespecifice dintre selectină și nanoparticule. Figura 3.71 prezintă două alte exemple de NP-uri care nu au prezentat niciun efect inhibitor în testul de legare competitivă. a) b) Au N N Au S H Figura 3.71: a) DMAP coord. Au-NP și b) Pol1-coord. Au NP 9.
21 Chiar și la concentrații mari de NP, după incubarea NP-urilor care nu se leagă cu L-selectină, s-a obținut o legare relativă de 100% și, prin urmare, nu s-a obținut nicio inhibare. Ca rezultat, nu există interacțiuni măsurabile, nespecifice, între selectină și PN. Pe scurt, valorile IC50 din intervalul picomolar au fost obținute pentru toate NP-urile polisulfatate cercetate aici, indiferent de structură. Structura ligandului și în special dispunerea spațială a grupurilor disponibile pentru legarea la selectină au exercitat o influență puternică asupra proprietăților de legare ale NP-urilor. Cu structuri mai complexe, ar putea fi obținut și un comportament de legare selectivă la L- și P-selectină. Selectivitatea P a apărut în special în cazul liganzilor care erau ușor maleabili și care nu solicitau steric. Structurile simple au inhibat ambele selectine cu valori similare IC50. O predicție fiabilă a 9 Polimerului Pol1 a fost sintetizată de Marie Weinhardt. 134