Influența colesterolului asupra motilității celulelor părului exterior ale cohleei cobai

Influența colesterolului asupra motilității celulelor de păr exterioare ale cohleei cobaiului și asupra proteinei motorii prestin Johannes Michael Schmid

De la Clinica și policlinica de medicină pentru urechi, nasuri și gât de la Universitatea Ludwig Maximilians din München Director: Prof. Dr. med. Alexander Berghaus Influența colesterolului asupra motilității celulelor de păr exterioare ale cohleei de porc de guineea și asupra disertației de proteine motorii pentru obținerea titlului de doctor în medicină la Facultatea de Medicină a Universității Ludwig Maximilians din München prezentată de Johannes Michael Schmid de la München în 2011

Cu aprobarea Facultății de Medicină a Universității din MÇnchen Raportor: Coraportor: Priv.-Doz. Dr. med. M. Canis Prof. Dr. Magdalena GÉtz Prof. Dr. Frank Staub Dean: Prof. Dr. med. Dr. h.c. M. Reiser, FACR, FRCR Ziua examenului oral: 09.06.2011

I Cuprins Cuprins Cuprins Pagina I. Introducere. 1 1. Importanța auzului. 1 2. Anatomia urechii interne. 2 3. Fiziologia cohleei. 5 3.1 Transmiterea sunetului și tonotopie. 5 3.2 Potențial endococlear și transducție mecanoelectrică. 5 3.3 Amplificarea semnalului de către celulele de păr exterioare. 7 3.4 Transmiterea informațiilor prin celulele interioare ale părului. 11 4. Prestina proteinei motorii și structura fină a membranei celulare a celulelor părului exterior. 11 4.1 Identificarea Prestinului. 11 4.2 Structura fină a membranei celulare a celulelor părului exterior. 12 4.3 Structura structurală și localizarea prestinei. 13 4.4 Funcția Prestinului. 15 5. Capacitate neliniară și electromotilitate a celulelor exterioare ale părului. 16 6. Colesterolul și influența acestuia asupra procesului auditiv. 17 6.1 Structura chimică și semnificația generală. 17 6.2 Importanța colesterolului pentru membrana plasmatică. 19 6.3 Efectele colesterolului asupra urechii interne. 20 7. Întrebări și obiective. 24 II.Material și metode. 26 1. Material. 26 1.1 Dispozitive. 26 1.2 Consumabile. 27 1.3 Produse chimice și soluții. 27 1.3.1 Produse chimice. 27 1.3.2 Soluții. 28 1.4 Software. 29

III Cuprins 2. Motilitatea celulelor părului exterior în condiții fiziologice. 53 3. Influența colesterolului asupra motilității celulelor externe ale părului. 55 3.1 Considerații generale. 55 3.2 Dependența motilității celulelor părului exterior de concentrația de colesterol. 56 3.2.1 Influența colesterolului asupra scurtării și prelungirii maxime. 56 3.2.2 Influența colesterolului pe panta maximă, pe modificările medii de lungime și pe tensiunea V pkc. 58 3.3 Influența colesterolului asupra prestinei proteinei motorii și asupra membranei celulare a celulelor părului exterior. 60 3.3.1 Influența clorurii asupra motilității celulelor externe ale părului. 60 3.3.2 Influența colesterolului cu funcție de prestină pe jumătate maximă. 62 V. Rezumat și perspectivă. 64 VI. Lista de abrevieri. 68 VII. Lista figurilor. 69 VIII. Lista tabelelor. 71 IX. Bibliografie. 72 X. Mulțumiri. 78 XI. Publicații. 79 XII. Relua. 81

I. Introducere 4 Figura 1: Anatomia urechii interne A: Prezentare generală cu cohleea deschisă B: Secțiune transversală prin bobinele cohleei C: Reprezentare schematică a organului Corti cu celulele exterioare și interioare ale părului (modificat de la Hudspeth 2000 și Knirsch 2007) (Knirsch 2007 )

7 I. Introducerea fluctuează între -60 mv și -80 mv (Rajagopalan și colab. 2007) (Figura 3). Forța motrice din spatele acestor curenți ionici este diferența de potențial dintre potențialul de membrană al celulelor de păr și potențialul endococlear (Klinke și colab. 2005; Schmidt 2007; Speckmann și colab. 2008). Figura 3: Potențialul receptorului în funcție de devierea stereoviliilor (modificat din Speckmann și colab. 2008 și Rajagopalan și colab. 2007) 3.3 Amplificarea semnalului de către celulele exterioare ale părului Afluxul de ioni în ETC și modificările asociate ale potențialului activează funcția de amplificare a ÄHZ (Breneman și colab. 2009). Această funcție de întărire se bazează pe două mecanisme, motilitatea somatică și cea ciliară. Ambele mecanisme cresc oscilațiile undei de deplasare de până la 1000 de ori cu mișcări active ale EHZ (Schmidt 2007; Dallos 2008). În motilitatea ciliară, aceasta are loc prin mișcări active ale stereovililor, în timp ce motilitatea somatică se bazează pe prelungirea și scurtarea corpului celulei. Acest mecanism, cunoscut sub numele de amplificator cohlear, crește selectivitatea frecvenței și sensibilitatea organului auditiv. Sunt ÄHZ prin substanțe ototoxice

I. Introducere 10 Figura 5: Motilitatea ciliară (modificată din Fettiplace 2006 și Breneman și colab. 2009) Luând împreună rezultatele actuale ale cercetării, Hudspeth a propus că motilitatea ciliară reprezintă un fel de preamplificator și modulator de frecvență, în timp ce motilitatea somatică acționează ca un amplificator final. ar putea (Hudspeth 2008). Amplificatorul cohlear funcționează dinamic. Oferă posibilitatea de a amplifica intensități sonore foarte mici, în timp ce intensități sonore mari sunt procesate fără amplificare. Acest lucru previne deteriorarea urechii interne. Un control automat al câștigului sub formă de efecte inhibitoare asigură un echilibru mecanic. Cel mai bine cercetat efect inhibitor este mediat de neurotransmițătorul acetilcolină. Acetilcolina este principalul transmițător al fibrelor eferente care inervează EHZ. Prin legarea la receptori specifici, Ca 2+ curge în celulă. Acest lucru duce la o ieșire întârziată a K + și, astfel, la o hiperpolarizare a celulei. Acest lucru duce la o reducere a sensibilității la tensiune a ETC și la o inhibare a electromotilității (Frolenkov 2006; Ashmore 2008).

12 I. Introducere. Liberman și colab. au putut confirma această teorie în 2002. Au arătat că atunci când exonii 3-7 din gena codificatoare au fost șterse, șoarecii au prezentat o pierdere a produselor de distorsiune a emisiilor otoacustice (DPOAE) și electromotilitatea EHZ, precum și o creștere a pragului auditiv de 40-50 db (Liberman și colab. 2002). 4.2 Structura fină a membranei celulare a celulelor părului exterior Prestina proteică motorie se găsește aproape exclusiv în membrana celulară laterală a ÄHZ (Ashmore 2008) (Figura 6). Figura 6: Structura membranei celulare laterale a celulei de păr exterioare (modificată de la Oghalai și colab. 1998) La capătul apical al ETC, stereovilii sunt atașați la placa cuticulară. Nucleul se află la baza celulei. Membrana celulară a peretelui lateral are o structură unică în trei straturi. Stratul exterior este membrana plasmatică (PM), în care sunt încorporate 3000 până la 6000 de molecule de prestină per µm². Densitatea prestinului depinde de localizarea ETC în cohlee. EHZ apical că

I. Introducere 14 Reconstrucția tridimensională a Prestin de către Mio și colab. a rezultat o proteină care măsoară 7,7 nm x 7,7 nm x 11,5 nm sub forma unui pistol în formă de glonț cu cavități interne (Mio și colab. 2008) (Figura 8). Figura 7: Reprezentarea schematică a structurii și localizării prestinei în membrana plasmatică a celulelor externe ale părului (modificată din Ashmore 2008) Figura 8: Reprezentarea tridimensională a prestinei în membrana plasmatică (modificată din Mio și colab. 2008)

17 I. Introducere Compararea cu investigațiile modificărilor de lungime a ÄHZ cu alte metode, de ex. microscopia video utilizată în această lucrare (Ashmore 2008). Figura 10: Reprezentarea grafică a NLC, mișcarea de încărcare și schimbarea lungimii în funcție de potențialul membranei (modificat din Ashmore 2008) Mulți factori, cum ar fi de ex. starea de fosforilare a proteinelor sau substanțelor intracelulare, cum ar fi cloroformul, gadoliniul, salicilații sau colesterolul, pot influența aceste procese. Mutați aceste curbe fie în direcția depolarizării, fie în direcția hiperpolarizantă sau modificați cea mai mare schimbare de lungime sau cea mai mare mișcare de încărcare. În această lucrare, efectul colesterolului asupra motilității EHZ a fost investigat în mod specific (Ashmore 2008). 6. Colesterolul și influența acestuia asupra procesului auditiv 6.1 Structura chimică și semnificația generală Premiul Nobel Michael Brown a descris colesterolul ca o moleculă cu cap Janus (Berg și colab. 2007). Pe de o parte, este o parte indispensabilă a celulelor noastre, pe de altă parte, dăunează organismului uman, de ex. din cauza aterosclerozei (Yeagle 1985). Colesterolul reprezintă o parte esențială a membranei plasmatice a majorității

25 I. Introducere Pentru a putea face diferența dintre colesterolul de pe membrana celulară și de prestina proteică motorie, funcția de prestină a ETC trebuie redusă prin reducerea concentrației de clorură intracelulară la aproximativ 50% (Oliver și colab. 2001). ETC-urile cu jumătate din funcția prestin sunt apoi împărțite în două grupuri de testare. Primul grup este examinat cu o concentrație extracelulară de colesterol de 1,0 mmol/l, al doilea grup fără colesterol adăugat. Evaluarea acestor experimente ar trebui apoi să răspundă la întrebarea dacă influența colesterolului este mai mult rezultatul efectelor asupra proprietăților pasive ale membranei celulare sau se bazează mai mult pe un efect asupra funcției prestinei proteinei motorii.

II. Material și metode 26 II. Material și metode 1. Material 1.1 Pregătirea echipamentului Stereomicroscop sursă de lumină rece Pregătirea soluțiilor Osmometru electronic Wild M3C KL 1500 cu punct de congelare Osmomat 030 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germania Schott AG, Mainz, Germania Gonotec GmbH, Berlin, Germania Pipete Reference Hamburg, Eppendorf AG, Patch-Clamp-Stimulation Electrode Glass Glass Patch-Clamp-Table/Faraday Cage Patch-Clamp-Amplifier Patch-Pipette Holder/Preamplifier DMZ-Universal Puller Micro-g Axopatch 200A CV-201A headstage Germania Zeitz Instruments GmbH, Martinsried, Germania TMC, Peabody, MA, SUA Axon Instruments Inc., Foster City, CA, SUA Axon Instruments Inc., Foster City, CA, SUA

27 Convertor analog-digital Micromanipulator Digidata 1200 Model XR-6 Înregistrări video Microscop Axiovert 135 Cameră video Moticam 2000 II. Material și metode Axon Instruments Inc., Foster City, CA, SUA Narishige Scientific Instrument Lab., Tokyo, Japonia Carl Zeiss AG, Göttingen, Germania Motic Deutschland GmbH, Wetzlar, Germania 1.2 Consumabile pentru vârfuri de pipetă 10 µl, 100 µl, 1000 µl capilare din sticlă borosilicată GC150TF-10 Acoperire Petri acoperită cu poli-L-lizină (Ø 35 mm) Eppendorf AG, Hamburg, Germania Clark Electromedical Instruments, Pangbourne, Reading, Marea Britanie Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germania 1.3 Produse chimice și soluții 1.3.1 Produse chimice pentansulfonat de sodiu colesterol solubil în apă HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, SUA Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, SUA Biochrom AG, Berlin, Germania

II. Material și metode 28 1.3.2 Soluții Soluții de pipetă (soluții intracelulare) (în mmol/l) Substanță Soluție standard Soluție cu 6 mmol/l clorură KCl 140 6 Pentanesulfonat de sodiu 0 134 MgCl 2 6H 2 0 2 2 EGTA 11 11 CaCl 2 0, 1 0,1 Hepes 10 10 KOH pentru stabilirea unei valori ph de 7,2 glucoză pentru stabilirea osmolarității a 315-320 soluții de baie mosmol/l (soluții extracelulare) (în mmol/l) soluții standard de soluție de substanță cu (soluție HBSS) 0,1 mmol/l, 0,5 mmol/l, 1,0 mmol/l, 1,5 mmol/l colesterol 0 colesterol CaCl 2 1,25 1,25 glucoză 5,55 5,55 KCl 5,4 5, 4 KH 2 PO 4 0,35 0,35 MgSO 4 7H 2 O 0,81 0,81 NaCl 137 137 Na 2 HPO 4 2H 2 O 0,34 0,34 Hepes 5 5 NaOH pentru setarea unei valori ph de 7.2-7.4 glucoză pentru ajustarea osmolarității a 300-310 mosmol/l

II. Material și metode 32 Figura 13: Configurațiile de măsurare ale tehnicii patch-clamp și producția lor (modificat de la Numberger 1996) 1. Configurație atașată la celulă: configurația atașată la celulă corespunde poziției de pornire pentru toate celelalte configurații. În această configurație nu este posibil să se intervină în mediul intracelular al celulei. Celula este măsurată într-o stare în care toate proteinele, inclusiv canalele ionice, se află în mediul lor natural de pe partea intracelulară a membranei. Doar zona de sub pipetă, patch-ul, este controlată de potențialul extracelular al amplificatorului.

II.Material și metode 34 de tabele mobile de microscop au fost echipate. Imaginea mărită a fost înregistrată cu o cameră video digitală (Moticam 2000, Motic Deutschland GmbH, Wetzlar, Germania) și stocată digital pe un computer. Un micromanipulator hidraulic (Model XR-6, Narishige Scientific Instrument Lab., Tokyo, Japonia) a fost folosit pentru a poziționa pipeta de patch-uri. Electrodul de baie din interiorul pipetei patch-uri a fost conectat la un preamplificator (faza principală CV-201A, Axon Instruments Inc., Foster City, CA, SUA). Figura 14: A: Structura stației de măsurare a clemei de patch-uri B: Mărirea mesei microscopului cu placa Petri și pipeta de patch-uri (modificată din Scheel 2002) (Scheel 2002) Presiunea negativă necesară pentru aspirarea celulelor a fost creată de o seringă perfuzor conectată la suportul pipetei. Preamplificatorul a fost conectat la un amplificator (Axopatch 200A, Axon Instruments Inc., Foster City, CA, SUA),

37 II.Material și metode 2.2.6 Măsurarea rezistenței electrodului și corectarea offsetului Pipeta a fost umplută și fixată în suportul pipetei astfel încât vârful pipetei să fie scufundat în soluția de baie. O ușoară suprapresiune a împiedicat înfundarea pipetei de particulele aspirate. Cu programul pclamp 8 a fost generat un impuls de test negativ cu o tensiune de 5 mV pe o perioadă de 5 ms. Din răspunsul curent rezultat, programul a calculat rezistența curentă a electrodului pe baza legii lui Ohm. În teste, această rezistență a fost între 3 MΩ și 6 MΩ (Figura 15 A). Figura 15: Modificarea rezistenței și a răspunsului curent la impulsul de test indus de pipeta patch-ului în funcție de configurația aparatului de fixare a patch-urilor (modificat din Numberger 1996)

II. Material și metode 38 Tensiunile care nu provin din celulă sau din pulsul de testare se numesc potențiale de offset (Numberger 1996). Aceste potențiale declanșate de polarizarea electrozilor de argint/clorură de argint și de potențialele de tranziție între diferite concentrații de electroliți din baie și pipetă pot falsifica rezultatele măsurătorilor. Aceste potențiale trebuie compensate cu ajutorul amplificatorului patch clamp înainte de fiecare măsurare și nu trebuie să depășească 10 mV (Numberger 1996). 2.2.7 Clemă de patch-uri cu celule întregi și stimulare Celulele vitale adecvate au fost selectate la microscop la mărire redusă. Criteriile de vitalitate ale lui Zajic și Schacht (Zajic și colab. 1987) au fost utilizate pentru a evalua celulele. Celulele au prezentat stereovili cu aspect rigid, un nucleu celular situat la polul bazal, mișcări ușoare, aleatorii ale particulelor citoplasmatice și o membrană celulară constantă (Figura 16). Figura 16: Celulă de păr externă izolată cu resturi de țesut de susținere și pipetă de plasture