Infuzia subcutanată de angiotensină II utilizând pompe osmotice induce anevrisme aortice la șoareci

rezumat

Implantarea subcutanată a pompelor osmotice oferă o abordare convenabilă pentru o livrare mai lungă și mai consistentă a conexiunii. Această abordare a fost utilizată pe scară largă pentru a studia atât anevrismele aortice abdominale cât și cele toracice la șoareci.

Introducere

Anevrismele aortice prezintă mărirea permanentă a lumenului aortei, ceea ce sugerează ruperea și de obicei duce la moarte. Această boală apare atât în ​​regiunile aortice abdominale, cât și în cele toracice, care sunt denumite anevrisme aortice abdominale (AAA) și, respectiv, anevrisme toracice aortice (TAA). Datorită unei înțelegeri incomplete a mecanismelor moleculare și a proceselor fiziopatologice, nu există nicio terapie medicală dovedită care să poată preveni expansiunea sau ruperea oricărui tip de anevrism aortic. Deoarece este dificil să obțineți probe de pacienți și să efectuați experimente direct pe oameni, cercetările axate pe definirea mecanismelor AAAS au fost deseori extrapolate din modelele animale. Un model animal utilizat în mod obișnuit este perfuzia subcutanată de angiotensină II (AngII) la șoareci. În comparație cu alte abordări chirurgicale pentru inducerea AAA la șoareci, cum ar fi perfuzia elastază intra-aortică sau aplicarea peri-aortică de clorură de calciu, care necesită laparotomia 1,2, această metodă nu necesită intrarea în cavitatea corpului și necesită o abilitate chirurgicală minimă 3,4.

Infuzia de AngII la șoareci are ca rezultat o extindere profundă a regiunii aortice toracice, care se limitează în cea mai mare parte la aorta ascendentă, care este cea mai comună regiune pentru TAA la om 19,22-26. Similar cu AAA induse de AngII, TAA induse în timpul perfuziei cu AngII recapitulează, de asemenea, multe funcții ale TAA umane 25. Cu toate acestea, spre deosebire de AAA induse de AngII, TAA induse de AngII nu sunt asociate cu hipercolesterolemie și nu au diferențe de gen.

Scopul general al perfuziei subcutanate de AngII la șoareci este de a studia caracteristicile patologice și mecanismele moleculare ale AAAS și TAA.

Protocol

Declarație de etică: Studiile la șoareci sunt efectuate cu permisiunea Comitetului instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Kentucky (numărul protocolului IACUC: 2006-0009). După punere, șoarecii sunt supradozați cu un cocktail de ketamină (

1. Calculul cantității AngII

Notă: Acest protocol se bazează pe exemplul de perfuzie AngII (1.000 ng/kg/min) hrănit cu o dietă saturată îmbogățită cu acizi grași timp de 4 săptămâni la 4 șoareci masculi cu receptor LDL -/-.

  1. Se cântăresc șoarecii de studiu înainte de a calcula cantitatea de AngII necesară perfuziei.
  2. Folosiți șablonul (Masa 1) pentru a calcula masa AngII necesară experimentului. Utilizați „Viteza medie a pompei” în instrucțiunile de utilizare a pompelor ca „Viteza pompelor” prezentată în pasul 4 al șablonului. În șablon înregistrați manual pașii 1-5, iar pașii 6-10 sunt calculați automat.
    1. În opinia că șoarecii vor primi 1 g greutate corporală în timpul perfuziei de 1000 ng AngII/kg/min timp de 4 săptămâni.
      NOTĂ: Fiecare șoarece are câștiguri de greutate corporală foarte diferite, care depind de multe variabile, cum ar fi tulpina și dieta de șoarece. Folosim în mod obișnuit „0” sau „1 g” pe baza experienței noastre din studii anterioare.
    2. Calculați un volum total de 300 μl de soluție AngII pentru fiecare șoarece, deoarece fiecare pompă necesită aproximativ 250 μl.

2. Dizolvarea AngII

  1. Păstrați flacoanele AngII liofilizate la -20 ° C. Se echilibrează flacoanele AngII la temperatura camerei înainte de deschidere.
  2. Se cântărește masa AngII calculată (7,3 mg, ca în Tabelul 1 este prezentat) într-un tub de plastic steril.
    NOTĂ: Conform indexului Merck, nu utilizați tuburi de sticlă pentru dizolvare deoarece o soluție apoasă de AngII are o afinitate puternică pentru legarea de sticlă.
  3. Adăugați volumul calculat de soluție salină sterilă (1.200 μl) în tubul de plastic care conține AngII liofilizat, capac și amestecați prin inversare până când soluția este limpede.
  4. Etichetați numerele mouse-ului # 1, # 2, # 3 și # 4 pe tuburi de plastic sterile individuale cu capac (0,5-1,5 ml). Pregătiți soluția AngII sub o hota laminară pentru fiecare șoarece pe baza greutății corporale, ca la pasul 1.2 și Tabelul 1 calculat.
    1. De exemplu, pipetați 3,6 μl de soluție salină sterilă în tubul 1, apoi 296,4 μl de soluție de AngII și amestecați pipetând în sus și în jos ușor.
  5. Etichetați numerele mouse-ului pe tuburile de plastic cu capace (4 ml, sterile). Acestea vor fi utilizate pentru a incuba pompele așa cum este descris în pasul 3.13.

3. umplerea pompei osmotice

7. Imaginea în față a aortelor

  1. Tăiați aorta longitudinal prin curbura exterioară și interioară a arcului aortic și tăiați ramurile principale deschise, inclusiv artera carotidă stângă innominată și artera claviculară stângă. Pinul aortei plat cu așezarea adventitică exterioară lângă ceara neagră.
  2. Achiziționați o imagine de față a aortei suprafeței intime la aceeași mărire. Includeți o riglă în fiecare imagine pentru calibrare, așa cum apar în al 4-lea.

Rezultate reprezentative

4 șoareci de sex masculin -/- șoareci LDL descriși în protocol au fost eutanasiați după 4 săptămâni de perfuzii cu AngII. Aortele au fost recoltate, curățate și imaginate pentru a vizualiza dilatațiile aortice. Ca în Figura 3 este prezentată, aortele au diverse proprietăți, inclusiv dilatarea regiunii suprarenale (AAA; 3A), extinderea zonei de alpinism (TAA; 3B) sau extinderea ambelor zone (prezența ambelor AAA și TAA, Fig 3C), în timp ce morfologia la un șoarece a fost aproximativ normală (3D). Dilatarea aortei abdominale este cuantificată prin măsurarea lățimii maxime ex vivo a regiunii suprarenale, așa cum este indicat de linia roșie în 3A afișat. Pentru a măsura dilatația aortică ascendentă, aortele au fost tăiate și notate, ca în Figura 4 este prezentată. Suprafața intimă a fost măsurată cu linii roșii în zona aortică ascendentă (zona înconjurată de th în 4A) pentru a cuantifica TAA. O riglă a fost inclusă în fiecare imagine pentru a standardiza măsurătorile de atunci în două figuri 3 și 4 afișate.

utilizând
. Figura 1. Imagine reprezentativă a pompei osmotice umplute Fiecare pompă conține două părți: un corp principal și un moderator de debit. După umplerea corpului pompei cu AngII, moderatorul de debit este introdus pentru a sigila pompa.

utilizând
Figura 2. Procesul chirurgiei implantului de pompă (A) Șoarecele este plasat într-o glugă laminară cu un con nazal care eliberează continuu izofluran și oxigen adusi impreuna. (B) Un hemostat drept este introdus în incizie pentru a forma un tunel subcutanat; (C) Pompa este ușoară prin incizia cutanată inserată; (D) Incizia cutanată este capsată după introducerea pompei.

infuzia
Figura 3 Imagini aortice (ex vivo) de șoareci infuzați cu AngII AngII 1.000 ng/kg/min a fost perfuzat la receptorul LDL masculin -./- șoareci 28 de zile. (A) AAA însoțite de tromboză; Linia roșie (2,05 mm) arată măsurarea lățimii maxime aortice în regiunea suprarenală. (B) dilatarea aortică ascendentă (TAA) cu aorta abdominală aproximativ normală; (C) Dilatații profunde atât în ​​regiunile aortice ascendente, cât și în cele suprarenale (TAA și AAA); (D) aorta grosolan normală fără o mărire aparentă a regiunii aortice ascendente sau suprarenale.

4.jpg "/>Figura 4. Imagini în fața regiunilor toracice aortice de la șoareci infectați cu AngII AngII 1.000 ng/kg/min a fost perfuzat în receptorii LDL masculi infuzat. -/- șoareci timp de 28 de zile. Zona conturată printr-o linie roșie reprezintă regiunea aortică ascendentă, inclusiv o parte a arcului aortic.

1 Doza necesară 1000 ng/kg/min
2 Porniți greutatea corporală (cel mai mare mouse) 24.8 G
3 Creșterea totală estimată a greutății corporale 1 G
Al 4-lea Rata de pompare 0,25 ul/oră
5 Număr de șoareci Al 4-lea
Al 6-lea Doza pe oră pentru animal 1518 ng
Al 7-lea Conc necesar 6072 ng/ul
A 8-a Pentru 300 μl de soluție 1,82 mg/300 u
O SOLUȚIE ESTE NECESARĂ
9 AngII total (mg) 7.3 mg
10 Dizolvat în soluție salină și # 160; 1.200 ul
șoarece greutate corporala Factorul de diluare Volum (ul) Greutatea pompei (g) Raport umplut
# (G) AngII Sărat Gol Umplut (%)
1 24.5 1.0 296.4 3.6 1.1443 1,3877 99
2 23.0 0,9 278.2 21,8 1.1677 1,4145 100
3 24.8 1.0 300,0 0,0 1,1438 1.3904 100
Al 4-lea 21,8 0,9 263,7 36.3 1,1438 1.3904 100
Factor de diluare = greutatea corporală a șoarecelui/cea mai mare greutate corporală a șoarecelui
șoarece greutate corporala Factorul de diluare Volum (ul) Greutatea pompei (g) Raport umplut
# (G) AngII Sărat Gol Umplut (%)
1 24.5 1.0 296.4 3.6 1.1443 1,3877 99
2 23.0 0,9 278.2 21,8 1.1677 1,4145 100
3 24.8 1.0 300,0 0,0 1,1438 1.3904 100
Al 4-lea 21,8 0,9 263,7 36.3 1,1438 1.3904 100

Tabelul 1: Calculul perfuziei de 28 de zile prin pompe osmotice.

Discuţie

Pompele osmotice care furnizează AngII subcutanat reprezintă o abordare de rutină a inducerii anevrismelor aortice la șoareci. Pe baza datelor de la multe laboratoare, rezultatele continue au arătat că aceasta este o metodă fiabilă și reproductibilă pentru examinarea atât a AAA 3.4, cât și a TAA 22-26 la șoareci. Prin urmare, acest model de șoarece este folosit ca un model care recapitulează mai multe funcții ale anevrismelor aortice umane și oferă o perspectivă mecanicistă asupra acestor boli devastatoare.

În timp ce îmbătrânirea este un factor de risc pentru AAA la om, nu a fost studiat sistematic pentru AAA induse de AngII la șoareci. Cu toate acestea, se pare că frecvența și severitatea AAA induse de AngII sunt similare la șoarecii cu vârste cuprinse între 8-48 săptămâni 4,5,7. În prezent, există doar câteva studii cu privire la TAA induse de AngII la șoareci cu vârsta cuprinsă între 8 și 24 de săptămâni, între 22 și 26 de ani, care nu au evidențiat diferențe evidente legate de vârstă la formarea TAA.

Pe scurt, perfuzia de AngII se realizează prin implantare subcutanată cu pompe osmotice pentru a induce anevrisme aortice la șoareci. Această metodă furnizează AngII continuu la o rată definită pentru anumite perioade de timp care sunt utilizate atât pentru studierea AAA, cât și a TAA.

Dezvăluiri

Publicarea acestui articol este sponsorizată de Alzet.