Intubația orală a peștilor zebră adulți Un model pentru evaluarea absorbției intestinale a compușilor bioactivi

rezumat

Protocolul descrie testarea peștilor zebra adulți cu un biologic; apoi disecați și pregătiți citometria, microscopia confocală și intestinul qPCR. Această metodă permite gestionarea substanțelor bioactive pentru a monitoriza absorbția intestinală și stimulul imun local evocat. Este relevant pentru examinarea dinamicii intestinale a profilaxiei orale.

Abstract

Introducere

În context biomedical, este interesant un model dezvoltat pentru a testa efectele biologice ale compușilor după intubația orală. Multe dintre caracteristicile anatomice și fiziologice ale intestinului sunt conservate între liniile bilateriene cu mamifere și pești osoși 11. Acest model de intubație orală conectat la analiza din aval poate fi un instrument pentru a oferi informații despre biologia umană, precum și un câmp de testare pentru biologici sau alte substanțe in vivo.

Protocolul de intubație orală poate fi realizat de către un operator, de exemplu, administrând cu succes până la 50 uL din suspensia de nanoparticule de proteine ​​cântărind 1 g, cu o rată ridicată de supraviețuire a pescuitului. Procesul este ușor de configurat și rapid; 30 de pești pot fi intubați într-o oră. Protocolul pentru prepararea intestinului este esențial pentru furnizarea de probe celulare și pentru analize ulterioare. Exemplele de rezultate din aval care demonstrează utilizarea protocolului în obținerea de date privind absorbția intestinală și ARN de calitate pentru izolatul qPCR. Protocolul ar fi de mare folos pentru cei care au un model adecvat pentru a testa dinamica profilaxiei orale sau a altor compuși din intestin.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Toate procedurile experimentale de pește zebră (Danio Rerio) au fost autorizate de comitetul de etică al Universității Autonome de Barcelona (numărul CEEH 1582) în conformitate cu principiile internaționale de ghidare pentru cercetarea animalelor (. UE 2010/63). Toate experimentele cu pește zebră viu au fost efectuate la 26-28 ° C.

1. Pregătiți echipamentul pentru intubația orală

  1. Așezați aproximativ 1 cm dintr-un tub fin de silicon pe un ac de blocare Luer de 31 G pentru a acoperi vârful acului.
  2. Tăiați un vârf de pipetă de filtru steril de 10 µL (aprox. 2 cm), luați capătul mai fin și așezați-l peste tubul de silicon ca un capac. Asigurați-vă că vârful acului iese din pipetă pentru a nu răni animalul.
  3. Așezați acul pe o seringă Luer Lock de 100 µL.
    NOTĂ: Clătiți cu etanol și apoi soluție salină tamponată cu fosfat (PBS, a se vedea materiale) temeinic între tratamente.

(2) soluțiile necesare

  1. Pregătiți soluție de 150 mg/L (pentru anestezie) sau 300 mg/L (pentru eutanasie) 3-aminobenzoat de etil metansulfonat (MS-222) soluție cu apă din acvariu unde sunt îngrijiți peștele zebră. Umpleți un recipient mic cu 1 L de soluție anestezică și păstrați-l aerisit.
  2. Umpleți un alt recipient mic cu 1 L de apă din acvariu fără recuperarea peștilor MS-222 și mențineți-l aerat.
  3. Se fac 50 mL de 1x PBS din 10x soluție stoc sterilă.
  4. Analiza citometrie/celulă intestinală izolată Se prepară suficientă soluție de colagenază tip IV de 0,15% proaspătă pentru 1 ml per pește dintr-o soluție stoc sau pulbere în mediu modificat Eagle (DMEM) Dulbecco cu 1% V/V penicilină și streptomicină (vezi materialul). Faceți alicote (1 pe pește) de 1 ml în tuburi de centrifugă de 2 ml. Țineți ritmul la 4 ° C până la 30 de minute înainte de disecție.
  5. Pentru a fixa microscopia/proba confocală, preparați 50 ml soluție proaspătă de 4% paraformaldehidă (PFA) cu tampon PBS sau dezghețați o soluție stoc într-un congelator de -20 ° C într-o hotă cu aburi.
    Atenție: PFA este toxic. Vă rugăm să citiți fișa cu date de siguranță înainte de a lucra cu el. Mănușile și ochelarii de protecție trebuie purtați și lăsați întotdeauna soluțiile într-o hotă de fum.

3. Producerea suspensiei de nanoparticule fluorescente

4. Anestezierea peștelui zebră și intubația orală

5. Disecția intestinală a peștilor zebră

7. Pregătiți criosecțiile intestinale pentru microscopia confocală

8. Pregătirea intestinelor pentru qPCR în timp real (RT-qPCR)

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

Peștele zebră de sex mixt (greutate medie: 1,03 ± 0,16 g) a fost intubat cu succes cu diferite nanoparticule de proteine ​​recombinante (corpuri de incluziune bacteriană) folosind dispozitivul nostru de intubație orală de casă (Figura 1). Am efectuat cu succes intubația orală și am obținut un procent mediu mediu de mortalitate (6,8%) (tabelul 1). Peștele zebraf a fost intubat fie cu 30 uL, fie cu 50 uL suspensii de nanoparticule și a fost calculată mortalitatea în 24 de ore după intubație. Experimentele au fost efectuate de doi operatori, R a avut mai puțină experiență în tratarea intubației orale de pește zebră decât J. Rezultatele au arătat că chiar și un nou operator ar putea efectua în mod independent experimente de intubație orală și ar putea obține cu ușurință o rată de supraviețuire ridicată prin acest protocol. Din experiența noastră, dimensiunea optimă a peștilor este de 1 g, dar am intubat cu succes pești de 0,5 g.

Pentru a înțelege mai bine dacă nanoparticulele fluorescente IBs TNF eină (o proteină citokină recombinantă nanostructurată ca corpuri de incluziune) peștele zebră este trecut prin metoda noastră și absorbit în intestinul zebră sau nu, am efectuat analize de citometrie. Nanoparticulele (100 pg/pește, 50 pL) și PBS (martor) au fost administrate pe cale orală la peștele zebră (prin intubație) și intestinul a fost disecat la 5 ore și 24 ore după intubație. Celulele intestinale totale au fost preparate din etapa 6 și analizate prin detectarea semnalului de emisie de fluorescență. Histogramele reprezentative ale intensității fluorescenței și graficelor punctuale ale procentului de celule fluorescente sunt prezentate în Figura 2afișate. Densitatea celulelor fluorescente este semnificativ mai mare în grupul intubat cu nanoparticule comparativ cu grupul martor în 5 ore și 24 ore (Fig. 2A.). Procentele de celule fluorescente sunt semnificativ mai mari în 5 ore (46,3%) și 24 ore (43,0%) din grupurile intubate cu nanoparticule (Figura 2B.).

Pentru a studia în continuare ce parte a stratului intestinal este implicată în captarea nanoparticulelor, am efectuat analize microscopice confocale. Nanoparticulele (20 pg/pește, 50 pL) și PBS (martor) au fost intubate oral pe pește zebră și intestinul a fost disecat la 5 h după intubare. Secțiunile intestinului au fost procedura de țesut înghețat după etapa 7(Figura 3)pregătit. Imaginile confocale ale nanoparticulelor fluorescente din intestin sunt prezentate în Figura 3B.afișate. Nanoparticulele fluorescente au fost găsite în intestinele de pește zebră. Am observat fluorescența în celulele epiteliale, lamina propria și celulele musculare.

Pentru a verifica dacă am putea extrage ARN de înaltă calitate prin protocolul nostru, am analizat ARN-ul extras din intestin utilizând un bioanalizator (denumit și aici analizor ARN). Peștele zebră a fost intubat oral cu PBS (50 uL) sau nanoparticulele (20 ug/pește, 50 uL). Intestinele au fost disecate pentru extracția ARN la 24 de ore după intubare. Avem șapte probe de ARN pentru a testa cu analizorul. Am constatat că toate probele de ARN testate au avut un număr ridicat de integritate a ARN variind de la 7,9 la 8,9 (Figura 4).

intubația

ilustrația 1 : Dispozitiv de intubație orală. (A.) Imaginea unui ac Luer Lock de 31 G pe o seringă de 100 µL cu tubul de silicon și vârful pipetei fixate peste vârful acului. (B.) o imagine mărită a părții acului. Săgeata neagră indică vârful pipetei care depășește capătul vârfului acului. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.

peștilor

Figura 4 : Imaginea de gel virtual a analizorului de ARN arată ARN extras din 7 intestine de pește zebră eșantionate după intubație. Numerele eșantionului 1 și 2 sunt grupuri de PBS intubate, iar eșantionul de la 3 la 7 sunt grupuri intubate cu nanoparticule. Numerele de integritate ARN (RIN) sunt date în partea de jos de la 7,9 la 8,9. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.

operator volum # Pește intubat Greutate medie
(g ± SD)		 # Decese Mortalitate (%)
R. 30 ΜL 22 0,88 ± 0,14 3 13.6
R. 30 ΜL 17 0,93 ± 0,19 0 0
J 50 ΜL 19 1,23 ± 0,31 1 5.2
J 50 ΜL 30 1,08 ± 0,40 2 6.6
În întregime 88 1,03 ± 0,16 Al 6-lea 6.8
SD: deviația standard a mediei

Tabelul 1: Comparația mortalității peștilor zebră cauzată de doi operatori care utilizează protocolul. Sunt afișate codul de identificare a operatorului, volumul intubat, numărul de pești și greutatea peștilor în grame (g).

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

Acest protocol este o îmbunătățire a tehnicii descrise anterior pentru intubația orală de către Collymore și colab. 4 din protocolul nostru descrie în detaliu metoda de intubație orală și include pregătirea intestinului pentru analiza ulterioară. Metoda noastră îmbunătățește viteza de manipulare a peștilor, astfel încât o persoană să poată efectua întregul protocol rapid și fără prea multe variații între operatori. O diferență majoră față de protocolul nostru cu precedentul este că evaluăm succesul experimentului de intubație orală nu numai prin observarea animalului pentru bunăstare (de exemplu, fără sângerare) și fără scurgeri de lichid administrat, ci și prin verificarea aportului a nanoparticulelor bioactive din intestin cu analiză ulterioară (citometrie, microscopie confocală și qPCR). Arătăm că nanoparticulele marcate cu penetrant intubat au fost găsite în intestin.

Limitările studiului nostru sunt dimensiunea peștilor, deoarece nu am testat administrarea la pești mai mici de 0,5 g și utilizarea unui anestezic chimic pentru a calma animalele. Unii autori folosesc apă rece (0-4 ° C) pentru anestezierea peștelui zebră, dar din punct de vedere al bunăstării animalelor și din perspectiva juridică europeană am decis că MS-222 ar fi metoda de alegere.

Peștele zebră oferă multe avantaje față de alte sisteme model, inclusiv un set complet de date genetice și liniile transgenice disponibile. Pentru imunologi, setați liniile transgenice (de ex. SF Mpx: GFP și Tg Mpeg1: GFP) ca scenă pentru observarea in-vivo a celulelor imune, cum ar fi Macrofage și Neutrofile 19, 20. Combinarea intubației noastre orale și a analizei din aval cu linii transgenice ar fi ideală pentru identificarea tipurilor de celule implicate în absorbția, transportul și prelucrarea vaccinurilor orale, nanoparticulelor și agenților patogeni la pești.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Dezvăluiri

Autorii declară că nu există niciun conflict de interese.

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută de subvenții din partea Ministerului Spaniol al Științei, a Comisiei Europene și a fondurilor AGAUR către NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER și 2014SGR-345 AGAUR). RT deține o subvenție predoctorală de la AGAUR (Spania), JJ a fost susținut de o subvenție de doctorat de la China Scholarship Council (China), iar NR se bazează pe programul Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Mulțumim Dr. Torrealba pentru consiliere competentă în producția de proteine, N. Barba de la "Servei de Microscopia" și Dr. M. Costa din „Servei de Citometria” al Universității Autonome din Barcelona pentru asistență tehnică utilă.