Investigații privind expunerea la acrilamidă și acroleină prin biomonitorizare alimentară și umană
1 Studii privind expunerea la acrilamidă și acroleină prin intermediul disertației biomonitorizante alimentare și umane D386 aprobată de Departamentul de chimie al Universității Tehnice din Kaiserslautern pentru acordarea diplomei academice Doctor în științe naturale prezentată de chimistul alimentar absolvent Meike Rünz Supravegherea lucrării: Prof. Dr. Elke Richling Data dezbaterii științifice:
3 Partea experimentală a acestei lucrări a fost realizată din aprilie 2013 până în februarie 2017 în departamentul de chimie, specializat în chimia alimentelor și toxicologie la Universitatea Tehnică din Kaiserslautern în grupul de lucru al prof. Dr. Elke Richling a interpretat. Președintele comisiei de examinare: Prof. Dr. Helmut Sitzmann Raportor 1: Prof. Dr. Elke Richling 2. Reporter: Prof. Dr. Dr. Dieter Schrenk
5 Cuprins I Cuprins Cuprins. I Lista abrevierilor. V abstract. X scurt rezumat. XI 1 Introducere Starea cunoștințelor Principii generale Evaluarea riscurilor Biomonitorizarea mediului și a omului Contaminanți alimentari induși de căldură Acrilamidă Proprietăți fizico-chimice Educație Sinteza industrială Formare exogenă Formare endogenă Niveluri în alimente Factori care influențează nivelurile din alimente Toxicocinetică Absorbție și distribuție Metabolism Excreție Toxicodinamică Toxicitate acută Neurotoxicitate Toxicitate reproductivă Toxicitate reproductivă Evaluarea expunerii Evaluarea expunerii utilizând monitorizarea mediului Evaluarea expunerii utilizând biomonitorizarea umană Caracterizarea riscului și gestionarea riscurilor Acroleină Proprietăți fizico-chimice Educație Sinteza industrială Formarea exogenă Formarea endogenă Niveluri în alimente Factori care influențează nivelurile din alimente. 52
6 II Cuprins Toxicokinetică Absorbție și distribuție Metabolism Excreție Toxicodinamică Toxicitate acută Toxicitate subcronică Toxicitate cronică Genotoxicitate și mutagenicitate Carcinogenitate Evaluarea expunerii Evaluarea expunerii utilizând monitorizarea mediului Evaluarea expunerii folosind biomonitorizarea umană Caracterizarea riscului Probleme Rezultate și discuții Dezvoltarea și validarea HPLC-ESI-MS-acrilamidă și acizi mercapturici asociați acroleinei în urină Studiu uman I Analiza dezvoltării greutății Analiza jurnalelor de activitate Analiza alimentelor Acrilamidă Acroleină proteină Asparagină Calcularea aportului alimentar zilnic Acrilamidă Aport de alimente foarte încălzite Aport de proteine Aport de asparagină Aport de carbohidrați Aport de grăsimi Aport de energie Analiză analiza acroleinei din aerul camerei a urinei subiecților testați volume de urină creatinină mercapturi asociate acrilamidei acizi mercapturici asociați acroleinei acide
7 Cuprins III 4.3 Studii privind eliberarea de acroleină, studiu la om II Calcularea cantităților zilnice de aport de alimente puternic încălzite Determinarea surselor de expunere la dietă exogenă nedietetică Analiza urinei subiecților testați Volume de urină Creatinină Acizi mercapturici asociați acroleinei Sumar Materiale Dispozitive Consumabile Produse chimice Metode Determinarea acrilamidei în alimente Prepararea probei Măsurarea eșantionului Dezvoltarea metodei Validarea metodei Parametrii HPLC și ESI pos-ms/ms Liniile de calibrare Determinarea acrilamidei și acizilor mercapturici asociați acroleinei în urină Pregătirea eșantionului Măsurarea eșantionului Elaborarea metodei Validarea metodelor HPLC și ESI parametrii neg-ms/ms Liniile de calibrare Estimarea nivelurilor de nutrienți și energie în alimente folosind Prodi 5.8 Expert Determinarea creatininei în urină Pregătirea experimentului Executarea experimentului Sinteza N-acetil-S- (3-oxopropil) -cisteinei Determinarea acrolei acizi mercapturici n-asociați în tampon de fosfat de potasiu Pregătirea probei Măsurarea probelor Calcule și statistici Calculul testului AUC Anderson-Darling Testul t pereche și nepereche
8 IV Cuprins Mann-Whitney U-Test Informații privind studiile la om Studiu uman I Aprobare legală Recrutarea subiecților Examen medical preliminar Screening alimentar (niveluri de acrilamidă) Informații suplimentare Studiu uman II Autorizare legală Recrutarea subiecților Examen medical preliminar Bibliografie Anexa CV i lista publicațiilor. iii Mulțumiri. v explicație. vii
9 Listă de abrevieri V Listă de abrevieri 8-OHdG AA AA-Hb AAMA AAMA-SO AC Ade AGE AKR ALARA ALDH AO AUC BfR BHA BHT BMDL BMI BSO BVL CA CAD CE CEMA CEP CHO cll c max CO 2 c predoză CRP CUR c spălare 8-hidroxidoxiguanozină Acrilamidă Aduct acrilamidă-hemoglobină N-acetil-S- (2-carbamoiletil) -L-cisteină N-acetil-S- (2-carbamoiletil) -L-cisteină-S-oxid acroleină adenină glicare avansată produse finale aldo-ceto-reductaza Cât de scăzut cât se poate de rezonabil cât de scăzut cât se poate de rezonabil Aldehid dehidrogenază Aminooxidază Zona sub curba sub curba Institutul Federal pentru Evaluarea Riscurilor Butilhidroxianisol Butilhidroxitoluen Limita inferioară de încredere a dozei de referință Doză de referință Limită mai mică de încredere Indicele de masă corporală energie de coliziune a gazului de disociere energie de coliziune celulă N-acetil-S- (2-carboxietil) -L-cisteină potențial de intrare a celulei intrittspotențiale Ovarele hamsterului chinezesc hamster chinezesc ovar leucemie limfocitară cronică concentrație maximă dioxid de carbon concentrație inițială proteină C reactivă cortină gaz cortină concentrație de gaz după o fază de spălare
17 Introducere 2 date insuficiente privind procentul de excreție a biomarkerilor de expunere. În funcție de procentul presupus de excreție de acroleină ca HPMA pe parcursul a 24 de ore, a fost determinată o expunere medie zilnică la acroleină de 2,1-24 µg/kg greutate corporală (SKLM, 2012). O expunere estimată prin intermediul biomonitorizării umane nu reflectă doar aportul de acroleină alimentară, ci și expunerea din formarea endogenă și din alte surse exogene de acroleină. Este necesar să se clarifice în ce măsură alimentele contribuie la excreția biomarkerilor de expunere la acroleină comparativ cu alte surse exogene de acroleină și/sau o formațiune endogenă.
32 17 Starea cunoștințelor Figura 13: Metabolismul acrilamidei, AA: acrilamida, AAMA: N-acetil-S- (2-carbamoiletil) -L-cisteină, AAMA-SO: N-acetil-S- (2-carbamoiletil) -L- cisteină-S-oxid, Ade: adenină, DHPA: 2,3-dihidroxipropanamidă, DHPS: acid 2,3-dihidroxipropanoic, ADN: acid dezoxiribonucleic, EH: epoxidhidrolază, GA: glicidamidă, GAMA: N-acetil-S- (2-carbamoil) -2-hidroxietil) -L-cisteină, GSH: glutation, GST: glutation-S-transferază, Gua: guanină, Hb: hemoglobină, izo-gama: N-acetil-S- (1-carbamoil-2-hidroxietil) - L-cisteină [modificat din (EFSA, 2015a), completat de (Sumner și colab., 2003; Doerge și colab., 2005a; Tareke și colab., 2006)]
35 Starea cunoștințelor 20 Reprezentarea eliberării de CO 2. Studiile exacte care ar demonstra această cale de degradare nu există încă. Conjugarea acrilamidei și glicidamidei cu glutation și descompunerea în acizi mercapturici. Pe lângă hidroliza epoxidului, detoxifierea acrilamidei și glicidamidei are loc și prin reacția cu glutation și metabolismul ulterior la acizii mercapturici corespunzători (vezi Figura 14). Figura 14: Formarea AAMA și AAMA-SO din acrilamidă și a GAMA și iso-gama din glicidamidă, AA: acrilamidă, AAMA: N-acetil-S- (2-carbamoiletil) -L-cisteină, AAMA-SO: N- Acetil-S- (2-carbamoiletil) -cisteină-S-oxid, DiP: dipeptidază, GA: glicidamidă, GAMA: N-acetil-S- (2-carbamoil-2-hidroxietil) -L-cisteină, GGT: -glutamil transpeptidază, Glu: acid glutamic, Gly: glicină, GSH: glutation, GST: glutation-S-transferază, izo-gama: N-acetil-S- (1-carbamoil-2-hidroxietil) -l-cisteină, NAT: N-acetiltransferază [modificat din (Duda-Chodak și colab., 2016)]
62 47 Starea cunoștințelor Figura 19: Căi postulate de formare a acroleinei din glucoză [modificat din (Stevens și Maier, 2008)] Formarea din aminoacizi și alți compuși amino Formarea din metionină O formare de acroleină indusă de căldură este descrisă și în contextul degradării Strecker a aminoacidului metionină vezi Figura 20). În cursul reacției Maillard, metionina și un compus dicarbonilic pot fi transformate într-o bază Schiff care, prin hidroliză, devine metoda aldehidei Strecker. Methional poate reacționa în continuare la metanetiol și acroleină prin clivajul retro-Michael (Stevens și Maier, 2008). Figura 20: Calea postulată de formare a acroleinei din metionină, R1 și R2: grupa alchil sau alchenil [modificat din (Stevens și Maier, 2008)]
70 55 Starea cunoașterii Figura 24: Metabolismul acroleinei. AC: acroleină, AC-GSH: AKR: aldo-ceto-reductază, ALDH: aldehidă dehidrogenază, CEMA: N-acetil-S- (2-carboxietil) -L-cisteină, ADN: acid dezoxiribonucleic, EH: epoxid hidrolază, FMO: flavin- monooxigenază dependentă, glicidaldehidă-MA: N-acetil-S- (2-carboxi-2-hidroxietil) -L-cisteină, GSH: glutation, GST: glutation-S-transferază, HPMA: N-acetil-S- (3- hidroxipropil) -L-cisteină, OPMA: N-acetil-S- (3-oxopropil) -L-cisteină, OPMA-SO: N-acetil-S- (3-oxopropil) -L-cisteină-S-oxid, α -oh-pdg: α-hidroxi-1n 2-propano-2-deoxiguanozină, -OH-PdG, -Hidroxi-1N 2-propano-2`-deoxiguanozină, Δ: detectat in vivo [modificat din (Parent și colab., 1998; Stevens și Maier, 2008)]
72 57 Capitolul Starea cunoștințelor). Mecanismul formării acidului glicidaldehidă-mercapturic din glicidaldehidă este prezentat în Figura 25, analog mecanismului bazat pe acroleină. Figura 25: Formarea HPMA și CEMA din acroleină și glicidaldehidă-MA din glicidaldehidă, AC: acroleină, AKR: aldo-ceto-reductază, ALDH: aldehid dehidrogenază, CEMA: N-acetil-S- (2-carboxietil) -L- cisteină, DiP: dipeptidază, FMO: monooxigenază dependentă de flavină, glicidaldehidă-MA: N-acetil-S- (2-carboxi-2-hidroxietil) -L-cisteină, GGT: -glutamil transpeptidază, Glu: acid glutamic, Gly: glicină, GSH: glutation, GST: glutation-S-transferază, HPMA: N-acetil-S- (3-hidroxipropil) -L-cisteină, NAT: N-acetiltransferază, OPMA: N-acetil-S- (3-oxopropil) - L-cisteină, OPMA-SO: N-acetil-S- (3-oxopropil) -L-cisteină-S-oxid [modificat din (Horvath și colab., 1992; Stevens și Maier, 2008)]