Jurnal de laborator - Metode - Mediu de cultură celulară optimizat
Mirja Krause
Producția de proteine recombinate solubile în celulele bacteriene nu funcționează întotdeauna fără probleme. Mirja Krause explică modul în care sistemul de cultură celulară En Base nou dezvoltat poate crește semnificativ densitatea celulară și cantitatea de proteină solubilă pe celulă.
Practic, sarcina culturilor de celule care este folosită pentru exprimarea proteinelor recombinante este foarte simplă: acestea ar trebui să producă proteine solubile cât mai active. Cu multe protocoale standard de cultură celulară, totuși, acest lucru funcționează doar parțial sau uneori deloc. Cel mai cunoscut protocol pentru cultivarea celulelor E. coli în baloane de agitare este probabil protocolul Sambrook, care este listat în „Biblia de biologie moleculară” a lui Tom Maniatis. De mai bine de 20 de ani, biologii moleculari au folosit acest protocol ca un ghid, care de multe ori funcționează - dar nu întotdeauna.
Proteinele care pot fi exprimate doar slab sau deloc folosind Sambrook sau un alt protocol standard sunt de obicei considerate a fi „candidați dificili” care necesită trucuri speciale. Aceste cazuri au fost găsite și în grupul nostru de lucru și am căutat adesea benzi ale proteinelor exprimate în geluri SDS-PAGE cu lupă.
Bacterii supra-consumate
Motivul producției slabe atunci când exprimă proteinele în culturile bacteriene este adesea un fenomen care apare și la om: bacteriile pur și simplu supraalimentează. Mediile pentru culturi de agitare de obicei „rulează” ca culturi de lot și conțin toate componentele și substanțele nutritive pentru cultură ulterioară încă din prima secundă. Procesul este în mare parte necontrolat, adică parametrii importanți precum valoarea pH-ului, cantitatea de oxigen dizolvat și concentrația de glucoză din mediu nu sunt controlate.
Ca urmare, rata respiratorie ridicată a bacteriilor cu creștere rapidă depășește rata de transfer de oxigen în cultură. Acest lucru duce rapid la epuizarea oxigenului și, prin urmare, la limitarea creșterii. Acum bacteriile cresc lent și reduc producția de proteine. Aceștia își adaptează metabolismul la condițiile de cultură anaerobă și eliberează metaboliți care scad valoarea pH-ului. În plus, cantitatea necontrolată de glucoză prezentă în mediile complexe standard duce la un metabolism în exces. Acest lucru determină acumularea de acetat suplimentar, care scade și mai mult valoarea pH-ului mediului de cultură până când bacteriile supra-consumate se îmbolnăvesc în cele din urmă.
Întregul lucru este întărit atunci când baloanele de agitare - așa cum este obișnuit în multe laboratoare - sunt închise cu dopuri de bumbac, folie de aluminiu sau capace metalice. Transferul de oxigen în culturi scade la zero și tranziția la anaerobă, adică condiții de cultură nefavorabile, este de asemenea accelerată. O soluție pentru transportul oxigenului în baloane este oferită de membranele de etanșare autoadezive, sterile, de unică folosință, așa-numitele sigilii AirOtop. Membranele AirOtop nu permit germeni din exterior în cultură, ci oxigen. Problema supraalimentării descrisă mai sus rămâne în continuare.
Pentru a menține celulele sănătoase, o cantitate definită de glucoză este pompată continuu în reactor în reactoarele de fermentație folosind așa-numitul proces alimentat în lot. În același timp, senzorii controlează valoarea pH-ului și conținutul de oxigen. În acest fel se pot atinge densități celulare foarte mari și pot crește producția de proteine recombinate solubile.
Dar cum poate fi transferat principiul lotului alimentat de la bioreactoare la baloane sau plăci de microtitrare? Pur și simplu: punând bacteriile pe o „dietă cu zahăr”.
Mediu din Finlanda
În urmă cu câțiva ani, grupul lui Peter Neubauer de la Universitatea din Oulu din Finlanda a dezvoltat sistemul de cultură celulară EnBase (eliberare de substrat pe bază de enzime), care eliberează glucoză în mediu într-un mod controlat prin digestia enzimatică a amidonului (Panula-Perälä și colab., Microbial Cell Fabrici 2008, 7:31). Între timp, inginerul bioproces Neubauer s-a mutat din nordul îndepărtat spre TU Berlin și a creat împreună cu echipa sa un alt mediu numit EnBase Flo, care conține polimeri care eliberează glucoză într-o formă solubilă.
Dieta cu zahăr
Cu EnBase Flo, cantitatea de glucoză din mediu poate fi controlată prin concentrația enzimei (glucoamilază) stabilită în cultură (Krause și colab., Microbial Cell Factories 2010, 9:11). Dieta cu zahăr previne excesul de metabolism dăunător al bacteriilor și asigură faptul că valoarea pH-ului rămâne stabilă mai mult de două zile și, astfel, semnificativ mai lungă decât în cazul mediului LB în care valoarea pH-ului este constantă doar timp de șase până la opt ore. Așa-numitele tablete de rapel întăresc suplimentar efectul de stabilizare a pH-ului. Astfel, bacteriile rămân sănătoase și pot fi cultivate în condiții controlate și stabile în care ating densități celulare semnificativ mai mari. În plus, randamentul proteinei solubile active crește de până la zece ori. Între timp, EnBase Flo Medium, care nu este potrivit doar pentru scara de laborator, ci și pentru procesele cu randament ridicat, este disponibil și în format tabletă sub numele EnPresso, ceea ce face cultivarea și mai ușoară.
Următorul protocol scurt ilustrează cât de simplă este cultura celulară cu sistemul EnBaseFlo. Pentru aceasta aveți nevoie de: un balon steril de 500 ml, apă sterilă, antibiotice, inductor și un set de tablete enpresso. Primul pas este pregătirea unei preculturi. Aceasta poate fi inoculată dintr-o cultură lichidă peste noapte, dintr-un stick de glicerol sau dintr-o placă de agar. Apoi, în condiții sterile, adăugați 50 ml apă sterilă și două tablete medii în balonul de 500 ml, așteptați până când tabletele se dizolvă și apoi adăugați antibioticul necesar și 50 µL EnZ’Im (glucoamilază). Precultura este apoi inoculată (OD 600 = 0,05 până la 0,15), balonul este închis cu membrana AirOtop și cultura este începută. După cultivarea peste noapte (16-20 ore), se adaugă o tabletă de rapel, 50 pl EnZ’Im și inductor. Cultivarea este apoi continuată și celulele sunt recoltate după 24 de ore.
Ultimele modificări: 23.02.2011