Măsurători ale răspunsurilor la stres fiziologic în C.

rezumat

Aici caracterizăm reacțiile de stres proteotoxic celular în nematodul C. elegans prin măsurarea activării reporterilor de transcripție fluorescentă și observarea sensibilității la stresul fiziologic.

stres

Abstract

Introducere

O mulțime de cunoștințe despre reglarea și activitatea răspunsurilor la stres celular au fost atribuite nematodului Caenorhabditis elegans, un organism model multicelular în cercetarea genetică. Nematodele permit studierea nu numai a activării reacțiilor de stres la nivel celular, ci și la nivelul organismului; Nematodele au fost utilizate pentru a studia efectele tulburărilor genetice sau ale expunerii la medicamente și poluanți asupra creșterii și supraviețuirii lor. Timpul lor rapid de generare, izogenia, transparența, capacitatea de tracțiune genetică și ușurința utilizării în timpul experimentării le fac ideale pentru astfel de studii. În plus, răspunsul fiziologic relativ rapid la stres (între ore și câteva zile) și conservarea evolutivă a căilor celulare fac din nematode un instrument excelent în studiul rezistenței la stres.

În plus față de analiza reporterilor, sensibilitatea sau rezistența animalelor la stres poate fi măsurată prin teste de stres fiziologic. Acest lucru se realizează prin expunerea animalelor la medii stresante care activează anumite căi de stres celular. Aici sunt oferite diverse metode pentru măsurarea sensibilității animalelor întregi la anumite tipuri de factori de stres.

Stresul ER se aplică la C. elegans folosind agentul chimic tunikamicină, care blochează glicozilarea legată de N și provoacă o acumulare de proteine ​​pliate greșit în ER 10. La C. elegans, creșterea duce la tulburări semnificative ale funcției ER și o durată de viață semnificativ redusă la expunerea la tunikamicină 11. Prin măsurarea supraviețuirii animalelor pe plăci care conțin tunikamicină, sensibilitatea ER la stres a animalelor poate fi cuantificată. De exemplu, animalele cu inducție ectopică UPR-ER și, astfel, rezistența crescută la stresul de pliere a proteinelor în ER au crescut supraviețuirea după expunerea la tunikamicină în comparație cu animalele sălbatice 12. EL

Stresul oxidativ și mitocondrial se aplică C. elegans prin expunerea animalelor la agentul chimic paraquat. Paraquatul este un erbicid utilizat în mod obișnuit, care determină formarea de superoxizi în mod specific în mitocondrii 13. Datorită localizării specifice a speciilor de oxigen reactiv derivat din mitocondrii (ROS), testele paraquat sunt adesea folosite ca test de stres „mitocondrial”. Cu toate acestea, superoxidul este transformat rapid în peroxid de hidrogen de către superoxidul dismutazei mitocondriale (SOD) 14. Peroxidul de hidrogen se poate difuza apoi din mitocondrie și poate provoca stres oxidativ în alte părți ale celulei. Prin urmare, descriem testele de supraviețuire paraquat ca o măsură a sensibilității atât la stresul mitocondrial, cât și la stresul oxidativ (alte teste de stres oxidativ vezi 15).

Testele de compatibilitate termică sunt efectuate la C. elegans prin plasarea animalelor la temperaturi ridicate. Temperaturile ambientale pentru nematode sunt de 15-20 ° C, iar stresul termic este indus la temperaturi peste 25 ° C 16, 17. Testele de compatibilitate termică se efectuează de obicei la temperaturi de 30-37 ° C, deoarece animalele au defecte celulare mari la această temperatură, iar testele de supraviețuire sunt finalizate în 24 de ore 16, 18. Două metode alternative sunt avute în vedere aici atunci când se efectuează teste de termotoleranță: creștere la 34 ° C și creștere la 37 ° C. Împreună, protocoalele prezentate aici pot fi folosite pentru a efectua ecrane pe scară largă atunci când sunt combinate cu eliminarea genei standard cu interferență ARN sau biblioteci de medicamente chimice.

Protocolul poate fi împărțit în 4 proceduri generale - creșterea C. elegans și pregătirea pentru imagistică (secțiunile 1 și 2), imagistica reporterilor de transcriere folosind microscopia fluorescentă (secțiunile 3-5), măsurători cantitative ale reporterilor folosind un flux mare de particule - Citometru (secțiunea 6) și ace fiziologice pentru a măsura sensibilitatea la stres la C. elegans (secțiunea 7).

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

1. Condiții standard de creștere a temperaturilor și OP50 față de HT115

2. Stadializarea/sincronizarea viermilor prin înălbire

5. Imagistica cu un stereo microscop sau un câmp larg/microscop compus cu mărire redusă

6. Măsurători cantitative de la reporteri cu un citometru cu flux mare de particule

NOTĂ: Creșterea și pregătirea viermilor pentru analiza continuă a citometrului cu particule mari poate urma aceleași paradigme ca secțiunile 1-5 pentru pregătirea viermilor pentru imagistica cu fluorescență, cu excepția faptului că este necesar un număr mai mare de animale . Utilizați> 500 de animale pe afecțiune, deoarece unele animale se vor pierde în timpul manipulării, nu toate animalele îndeplinesc criteriile de filtrare în timpul cuantificării, iar unele animale nu vor fi citite corect de citometrul de flux. Se spală animalele pentru sortarea plăcilor în 5-10 ml soluție M9 în tuburi conice de 15 ml pentru sortarea ulterioară pe citometrul de flux.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

Utilizarea reporterilor de transcriere pentru a măsura activarea răspunsurilor la stres
Aici sunt folosiți reporterii de transcriere fluorescentă, care servesc drept instrumente robuste pentru a măsura activarea majorității răspunsurilor la stres în C. elegans. Exprimarea GFP este condusă, sub sprijinul țintelor canonice, de către regulatorii transcripționali principali implicați în răspunsul la stresuri specifice subiectului. Pentru o listă cuprinzătoare a reporterilor de transcriere folosiți în mod obișnuit, consultați Tabelul 3.

Analize fiziologice pentru a măsura susceptibilitatea la stres la C. elegans
C. elegans sunt un model de organism excelent pentru măsurarea sensibilității la stres datorită costului redus de întreținere și a experimentelor și ușurința editării genomului sau a deranjării genetice cu RNAi, care oferă capacitatea de a efectua experimente la scară largă într-un întreg organism. Pentru a testa toleranța la stres la stresul ER, am expus C. elegans la tunikamicina chimică, care provoacă acumularea de proteine ​​deteriorate în ER prin blocarea glicozilării N-legate 10. Animalele sunt expuse la tunikamicină după dezvoltare, deoarece medicamentul provoacă defecte de dezvoltare. Atunci când sunt expuși la tunikamicină, viermii adulți prezintă o scădere semnificativă a duratei de viață. În plus, eliminarea genei xbp-1, care codifică unul dintre factorii de transcripție primari implicați în inducerea UPR ER, duce la o creștere semnificativă a sensibilității la tunikamicină (Figura 5A.) 12. ER Astfel, acesta servește ca un test robust pentru măsurarea sensibilității la stres ER la viermi adulți.

Pentru a măsura stresul oxidativ și stresul mitocondrial, expunem animalele la compusul chimic paraquat. Paraquatul provoacă stres mitocondrial prin sintetizarea ROS în matricea mitocondrială, care poate fi apoi transformată în peroxid de hidrogen și difuzată în afara mitocondriilor pentru a provoca leziuni oxidative ale celulelor întregi 13. Similar cu testele de stres ER, expunem animalele la paraquat la vârsta adultă. Cu toate acestea, facem teste lichide de paraquat pentru a reduce costurile și munca manuală, iar testele pe bază de plăci de agar ar fi dificile pentru majoritatea laboratoarelor. Aici arătăm că animalele expuse la paraquat în lichid lichid au o supraviețuire medie de aproximativ 5 ore (Figura 5B.). În plus, eliminarea receptorului de insulină daf-2 duce la o rezistență crescută la paraquat, deoarece activarea DAF-16/FOXO duce la o expresie crescută a speciilor implicate în eliminarea ROS, de ex. B. Sod-3 42, 43. Testele de supraviețuire pentru paraquat sunt scurte, durează până la 14 ore și, prin urmare, servesc drept metodă eficientă de a pune la îndoială răspunsurile la stresul mitocondrial și oxidativ.

Tabelul 3: Reporter de transcriere pentru evaluarea activării răspunsurilor la stres celular. Tulpinile enumerate aici sunt toate disponibile prin CGC sau prin anchete specifice către laboratoare pentru utilizare în procedurile de imagistică calitativă și cantitativă descrise în acest manuscris. Aceste tulpini sunt toate derivate din fundalul Bristol N2. Sunt furnizate și metode recomandate de aplicare a stresului pentru activarea reporterilor. Toți reporterii, cu excepția sod-3p: GFP 45 și T24B8.5p: GFP 46, sunt descriși în text.

Transgenic Aplicarea (aplicările) recomandată (e) de tensiune Timp de expunere cu un stereomicroscop Leica M2250FA Timp de expunere cu un microscop Revolve ECHO Valorile PMT cu un sortator organic Union Biometrica COPAS
hsp-4p: GFP 25 g/ml tunikamicină (aproximativ 4 ore cu recuperare nocturnă) 200 ms 275 ms 450
hsp-6p: GFP 3 M antimicină A (aproximativ 16 ore); 100ms 50 ms 350
ARNi împotriva ETC sau ribozom mitocondrial (din trapă)
hsp-60p: GFP 3 M antimicină A (aproximativ 16 ore); 200 ms 100 ms 450
ARNi împotriva ETC sau ribozom mitocondrial (din trapă)
hsp-16.2p: GFP 34 ° C 2 ore 400 ms 200 ms 500
hsp-70p: GFP 34 ° C 2 ore 400 ms 300 ms 500
gst-4p: GFP 50 mM paraquat (aprox. 2 ore); 100 ms 50 ms 350
2 mM hidroperoxid de terț-butil (aproximativ 4 ore cu recuperare nocturnă)
sod-3p: GFP ARNi împotriva Daf-2 (receptor de insulină) 300 ms 300 ms 475
T24B8.5p: GFP Expunerea la agenți patogeni (de exemplu P. aeruginosa) 100 ms 50 ms 350

Tabelul 4: Setări recomandate pentru microscopie fluorescentă și cuantificare cu un biosorter de particule mari. Acest tabel este conceput ca un ghid pentru timpul recomandat de expunere pentru microscopia fluorescentă sau valorile PMT pentru biosorterul cu particule mari. Acestea servesc drept puncte de plecare bune, dar timpul de expunere și valoarea PMT ar trebui ajustate pentru fiecare experiment pentru a se asigura că saturația nu are loc și că valorile fluorescenței sunt peste limita de detecție a semnalului de fundal. Dacă eșantionul cu cel mai luminos semnal este cunoscut pentru un experiment (de exemplu, controale pozitive pentru inducerea tensiunii), aceste eșantioane pot fi utilizate pentru a determina cel mai mare timp de expunere sau PMT care poate fi utilizat fără un semnal de saturație. Dacă nu sunt cunoscute cele mai strălucitoare probe, poate fi utilizat controlerul și poate fi utilizat un timp de expunere sau PMT în mijlocul intervalului dinamic al sistemului dvs.

Tabelul 6: Ținte de gene recomandate și perechi de primer pentru măsurarea reglării transcripționale a genelor de răspuns la stres.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

O altă limitare a metodelor descrise este că imagistica și cuantificarea de către un biosorter au un randament limitat. În timp ce cuantificarea poate fi efectuată pe biosortori în plăci cu 96 de godeuri pentru un randament mai mare, este încă limitată de necesitatea transferării viermilor în soluție, în timp ce imagistica este limitată de capacitatea examinatorului de a pregăti viermi și de a efectua microscopie este restrictionat. Prin urmare, ecranele mari vor include cel mai probabil doar ecranarea vizuală a semnalului reporter fluorescent, doar accesările fiind mapate și cuantificate.

Toate metodele descrise aici pot fi utilizate independent sau în combinație pentru o analiză cuprinzătoare a genelor sau medicamentelor de interes și a efectelor acestora asupra răspunsului la stres. Ecranele de format mare pot fi rulate cu teste ale reporterului cu transcriere mare, iar ecranele secundare pot fi rulate cu analiza cantitativă a acestor reporteri. De îndată ce sunt identificate din nou listele de gene/medicamente candidate gestionabile, pot fi efectuate teste fiziologice pentru a identifica candidații care au un impact direct asupra fiziologiei generale a animalelor. Celelalte metode sugerate mai sus pot fi, de asemenea, utilizate pentru validare sau investigații ulterioare.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.