Mimeticele Smac induc inflamații necrotice și moartea celulelor tumorale prin modularea

subiecte

abstract

Macrofagele sunt celule plastice care se caracterizează prin diferite stări de activare. 23 Macrofagele activate clasic (M1) și macrofagele activate alternativ (M2) reprezintă cele două extreme din spectrul fenotipului macrofagului. Macrofagele asociate tumorilor sunt clasificate ca macrofage M2 pe baza profilului lor de exprimare a citokinelor; 24 Produc niveluri ridicate de citokine imunosupresoare, cum ar fi interleukina-10 (IL-10) și, mai ales în tumorile solide, împărtășesc unele funcții de reparare a țesuturilor cu fibroblastele. 23, 25 În schimb, macrofagele M1 produc cantități mari de citokine pro-inflamatorii, inclusiv interferon-γ. (IFN & ggr;) și IL-12 și pot fi implicate în declanșarea unui răspuns imun eficient antitumoral. Plasticitatea macrofagelor a sugerat noi abordări terapeutice care vizează inversarea fenotipului M2 26, în special în tumorile în care infiltrarea macrofagelor precum carcinomul ovarian joacă un rol esențial. În consecință, într-un model de ascită ovariană de șoarece, macrofagele au fost generate prin modularea NF- & kgr; Semnalizarea B reprogramată. 27

Recent am descris sinteza de noi molecule dimerice care vizează XIAP, cIAP1 și cIAP2. 28, 29 Una dintre aceste molecule, SM83, a inhibat creșterea adenocarcinomului de sân uman sensibil la SM MDA-MB231 și a rabdomiosarcomului Kym-1, dar nu și a altor linii celulare. Aici folosim două modele de xenogrefe murine de ascită de cancer pentru a arăta că SM83, atunci când este administrat în monoterapie, crește supraviețuirea acestor șoareci prin vizarea macrofagelor asociate tumorii. Prin TNF, SM83 induce rapid necroza celulelor canceroase injectate intraperitoneal (ip) care sunt altfel complet rezistente in vitro la efectele antitumorale ale SM83. Munca noastră arată că SM83 are diferite mecanisme de acțiune in vitro și in vivo și că își exercită activitatea antitumorală in vivo prin stimularea sistemului imunitar.

Rezultate

SM83 sensibilizează linia celulară de carcinom ovarian IGROV-1 la efectele apoptotice ale TRAIL

SM83 induce apoptoza in vitro atunci când este combinat cu TRAIL. ( A ) Structura chimică a dimerului SM SM83. ( ) Celulelor IGROV-1 li s-au dat 0, 1 sau 1, 0 u M SM83 tratat singur sau în combinație cu 2 sau 10 ng/ml TRAIL. Creșterea celulară este exprimată ca procent în raport cu celulele tratate în mod vehicul. Valorile sunt media și SD dintr-un experiment, care este un experiment reprezentativ al a trei experimente efectuate. ( c și d ) Analiza Western blot a XIAP, cIAP1, cIAP2 și PARP clivat (Cl PARP) în celulele IGROV-1 care au fost tratate cu SM83 ( c ) sau SM59 (SM-164) ( d ) Tratat în absența sau prezența a 10 ng/ml TRAIL. Actina este prezentată ca un control al încărcării. Săgeată, bandă XIAP specifică

SM de monoterapie cresc supraviețuirea șoarecilor cu ascită de cancer

SM83 și SM59 au fost apoi testate in vivo folosind un model de xenogrefă murină în care celulele IGROV-1 au fost injectate ip la șoareci nudi atimici, rezultând ascită și moarte. Tratamentul cu SM83 (2a) și SM59 (2b) a crescut supraviețuirea șoarecelui (P.

Tratamentul cu SM83 în monoterapie crește supraviețuirea șoarecilor cu ascită de cancer. ( A ) Șoarecilor goi li s-au injectat ip cu celule IGROV-1 și au fost lăsați netratați (O) sau tratați de 5 ori pe săptămână timp de 2 săptămâni consecutive din ziua următoare injecției cu 5 mg/kg SM83 (l), 2,5 mg/kg TRAIL ( ∇) sau cu aceeași doză de SM83 și TRAIL împreună (▪). Este prezentat un experiment care reprezintă două efectuate. Fiecare grup de tratament conținea șapte șoareci. Curba de supraviețuire pentru șoareci și martori tratați cu SM83. ( ) Curba de supraviețuire pentru șoareci tratați cu SM59 și șoareci de control. Netratat (○) sau tratat cu SM SM59 (∇). ( c Formarea ascitei a fost verificată prin monitorizarea greutății corporale în ziua a 17-a. ( d și e ) Celulele Meth A au fost injectate în șoareci BALB/c și tratați cu 5 mg/kg SM83 zilnic din ziua a 7-a. ( d Formarea ascitei a fost verificată prin monitorizarea greutății corporale în ziua 13. Linia orizontală reprezintă media. ( e ) Curba de supraviețuire pentru șoareci netratați () sau tratați cu șoareci SM83 () din ziua 7

Pentru a testa dacă activitatea in vivo a SM83 a fost specifică liniei celulare sau a fost limitată la șoareci imunodeficienți, am folosit un alt model de ascită în care celulele sarcom Meth A de șoarece au fost injectate ip în șoareci imunocompetenți BENB/c. Similar cu celulele IGROV-1, celulele Meth A nu au fost inhibate de creștere de către SM83 in vitro (datele nu sunt prezentate). La șoareci, SM83 a scăzut progresia ascitei, care a fost considerată o creștere mai mică a greutății corporale (2d) și a crescut timpul mediu de supraviețuire de la 15 zile pentru animalele netratate la 26 de zile (P = 0,0721; 2e). Și în acest model, combinația cu TRAIL nu a fost avantajoasă (datele nu sunt prezentate). Când șoarecii vindecați cu SM83 (4 din 14 șoareci testați) au primit o nouă injecție de celule 4 × 105 Meth A (de două ori mai multe decât prima administrare), nu au existat noi ascite (datele nu sunt afișate). Aceste rezultate sugerează că aceste animale au dezvoltat imunitate adaptativă.

SM83 ucide rapid celulele canceroase care plutesc în ascită printr-un mecanism non-apoptotic

Pentru a studia mecanismul activității SM83 in vivo, lichidul de ascită a fost colectat de la șoareci injectați cu celule IGROV-1 și tratat cu SM83 timp de 3, 6 sau 24 de ore, iar celulele tumorale au fost numărate. Rezultatele au arătat o scădere remarcabilă (P.

Pentru a înțelege mecanismul morții celulare responsabile de scăderea numărului de celule tumorale plutitoare în ascită, am examinat expresia mediatorilor apoptozei în aceste celule în diferite momente de timp. După 24 de ore, tratamentul cu SM83 a dus doar la o ușoară creștere a PARP scindat, fără dovezi ale caspazei-8 active scindate (ceea ce era de așteptat deoarece aceste celule sunt ucise prin monoterapie SM in vivo) și doar un efect minor pe clivajul caspazei -3 (Figura 3d). În schimb, celulele tratate cu TRAIL au arătat o mai mare activare a acestor markeri apoptotici, deși TRAIL a fost ineficient în reducerea numărului de celule ascitice (Figura suplimentară S1). În încercarea de a detecta evenimentele apoptotice, Western blot a fost efectuat pe celulele colectate după 3 și 6 ore de tratament (3e). Și în acest caz, SM83 a provocat degradarea completă a cIAP1 și cIAP2, dar a existat doar o acumulare slabă a formelor clivate ale PARP, caspase-8 și caspase-3. Această activare scăzută a cascadei apoptotice a indicat faptul că cauza decesului celulelor tumorale ascitice nu a fost în primul rând apoptotică.

Pentru a evalua posibilitatea ca autofagia - un alt mecanism care poate duce la moartea celulelor dacă este activat în mod anormal și continuu - este responsabilă pentru pierderea celulelor tumorale ascitice, am măsurat nivelurile de Beclin-1 și LC3B scindat. Tratamentul cu SM83 nu a crescut nivelul acestor proteine (figura suplimentară S2), sugerând că autofagia nu este implicată în moartea celulelor tumorale indusă de SM83.

SM83 declanșează un eveniment inflamator in vivo

Tratamentul SM83 induce expresia citokinelor inflamatorii in vivo. Șoarecii goi au fost injectați ip cu celule IGROV-1 și tratați cu o singură doză de 5 mg/kg SM83 sau nu; Ascita a fost colectată la 3, 6 și 24 de ore după administrarea SM83. ( A ) SM83 a crescut temporar nivelul TNF al mouse-ului măsurat prin ELISA. ( ) Tratamentul cu SM83 a scăzut numărul celulelor ascitei, dar acest efect a fost blocat atunci când TNF a fost sechestrat cu doza mai mare de etanercept (P = 0,0118 comparativ cu tratamentul cu SM83 singur). ( c ) Western blots de proteină celulară tumorală ascită de la șoareci netratați și șoareci tratați cu SM83 singur sau în combinație cu 150 mg/kg etanercept. Săgeată, panglică specifică pentru XIAP. ( d - H ) Rezultate ELISA pentru IL-1? ( d ), IFN-? ( e ), IL-10 ( f ), factor de creștere transformator & bgr; (TGF-?) ( G ) și IL-4 ( H ) în lichidul de ascită de la șoareci tratați ca mai sus. Rezultatele pentru IL-10 sunt prezentate ca o inducție de ori datorită lipsei unui standard proteic recombinant

SM83 promovează activarea macrofagelor către un fenotip asemănător M1

Tratamentul SM activează macrofagele și le sensibilizează la moartea necrotică. ( A și ) BMDM BALB/c (5 × 105) au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri, au fost lăsate să adere timp de 16 ore și au fost injectate cu 1 μl până la 24 de ore. M SM83 manipulat sau nu. Tratamentul SM83 a promovat secreția citokinelor proinflamatorii TNF ( A ) și IL-1β ( ). ( c ) NF-? Activarea B de către SM83 evaluată în linia celulară de macrofage RAW transfectată stabil cu un NF-? Gena reporter B-luciferază. Este prezentat un experiment reprezentativ a două efectuate. Valorile sunt medii și SD; n = 3. ( d și e ) BMDM BALB/c au fost însămânțate în plăci cu șase godeuri, au fost lăsate să adere timp de 16 ore și au fost tratate cu diluții seriale de SM83 în absența sau prezența necrostatinei-1 sau z-vad-fmk pentru a inhiba necroptoza sau, respectiv, apoptoza. ( d) Imagini reprezentative care arată morfologia celulelor după 24 de ore de tratament. ( e ) Viabilitatea celulară după tratamentele evaluate utilizând testul CellTiter-Glo

Pentru a exclude posibilitatea ca IL-1 indusă de SM83? Secreția se datorează contaminării cu lipopolizaharide (LPS), am preparat BMDM de la șoareci TLR4 knockout (KO) și am constatat că IL-1? a fost secretat într-o măsură similară cu cea secretată de celulele BALB/c (Figura suplimentară S4). În plus, s-a constatat că preparatele SM83 pentru injecție nu conțineau cantități detectabile de LPS în testul Endosafe PTS (Charles River Laboratories, Calco, Italia) (datele nu sunt prezentate). Aceste rezultate indică faptul că IL-1 indusă de SM83? -Producția nu s-a datorat contaminării cu LPS.

Acumularea neutrofilelor în ascită

Neutrofilele au fost apoi izolate din splina șoarecilor cu deficit de receptor BALB/c (tip sălbatic) și TNF (TNF-R1) pentru a investiga rolul neutrofilelor în activitatea antitumorală a SM83 in vitro. În testele Transwell, migrația neutrofilelor de tip sălbatic către ascită de la șoareci tratați cu SM83 a fost mai mare decât cea de la șoareci netratați (6d). Inhibitorul HMGB-1 a redus parțial migrația, în timp ce neutrofilele de la șoareci cu deficit de TNF-R1 nu au migrat ca răspuns la ascită de la șoareci tratați cu SM83. Ascita de la șoareci tratați cu neutrofile de tip sălbatic activat de SM83 pentru a produce superoxid chiar și în prezența blocantului TNF etanercept, în timp ce glicirizina a blocat complet această activitate (6e). Aceste rezultate sugerează că migrația neutrofilelor în prezența ascitei de la șoareci tratați cu SM83 este stimulată de TNF, în timp ce activarea se datorează HMGB-1. Importanța TNF pentru migrarea neutrofilelor a fost, de asemenea, demonstrată in vivo, unde pretratarea etanercept a blocat recrutarea acestor celule în ascită (Figura suplimentară S5).

În rezumat, lucrarea noastră arată că SM83 acționează in vivo în ascita cancerului prin revenirea macrofagelor dintr-un fenotip asemănător M2 care susține tumora într-un fenotip asemănător M1 care este dotat cu activitate antitumorală. Macrofagele M1 secretă citokine precum TNF, IL-1? și IFN? provocând moartea necrotică rapidă dependentă de TNF a celulelor canceroase ale ascitei (7); Celulele pe moarte eliberează apoi HMGB-1, care împreună cu TNF stimulează o infiltrare masivă a neutrofilelor.

Propus mecanismul de acțiune al SM83 în ascita cancerului. SM83 stimulează inversarea macrofagelor de la fenotipul M2 la fenotipul M1. TNF secretat de macrofagele M1 declanșează moartea necrotică a celulelor canceroase din lichidul ascitei; Celulele pe moarte eliberează HMGB-1, care împreună cu TNF recrutează neutrofile

discuţie

În acest studiu, descriem activitatea in vivo a SM SM83 nou sintetizată în două modele de xenogrefă pentru ascita cancerului la șoareci. Arătăm că SM83 este eficient ca monoterapie in vivo pe celulele canceroase umane și murine care sunt rezistente la SM in vitro și arată că aceste celule mor printr-un mecanism non-apoptotic, dependent de TNF. De asemenea, oferim dovezi că SM83 își face activitatea prin declanșarea inflamației și activarea celulelor imune, rezultând moartea imunogenă a celulelor canceroase. În plus, studiul nostru arată că activitatea SM83 (și posibil a altor SM) în mediul complex in vivo diferă de cea deja observată in vitro.

Într-un microambient tumoral, inclusiv cancer ovarian, macrofagele dobândesc un fenotip asemănător M2. 38, 39 Cu toate acestea, unii autori au propus strategii diferite 23, 24 care pot schimba starea macrofagelor în direcția unui răspuns antitumoral eficient. În acest context, s-a arătat și posibilitatea creșterii eficacității terapiilor standard care perturbă macrofagele M2, 40 în special în tumorile a căror progresie se bazează strict pe sprijinul lor, cum ar fi carcinomul ovarian. Aceste tumori creează o relație complexă cu celulele imune asociate din ascită, 41 și dezvoltă un microambient imunosupresor produs de macrofage. Prin urmare, în cancerul ovarian, repolarizarea macrofagelor sau inhibarea recrutării acestora ar putea fi o nouă strategie terapeutică eficientă.

Rezultatele noastre sugerează că SM reglează răspunsul imun la ascita cancerului prin polarizarea macrofagelor și, astfel, au potențial terapeutic. De fapt, Smac/DIABLO 42 și mimeticul SM83 prezentate aici declanșează moartea celulelor necrotice sau necrotice. Celulele necrotice, altele decât apoptotice, eliberează o formă imunogenă neoxidată de alarmin HMGB-1 43 care activează celulele dendritice prin activarea receptorilor pentru produsele finale glicante avansate, receptorii TLR4, TLR7 și TLR9. 44 În plus, celulele necrotice pot antrena celulele CD4 + T, care sunt esențiale pentru dezvoltarea unui răspuns imun adaptiv. 45 Posibilitatea ca un răspuns imun adaptiv să fie declanșat de necroza indusă de SM83 este crescută de rezultatele noastre atunci când se utilizează șoareci imunocompetenți BALB/c cu ascită metamfetaminică. Unii dintre acești șoareci au fost vindecați prin tratamentul SM83 și nu au dezvoltat ascită suplimentară atunci când au fost expuși la o nouă doză dublă de celule Meth A, sugerând că erau imuni la celulele sarcom Meth A.

Pe scurt, datele noastre arată că SM83 este activ în monoterapie prin promovarea inflamației și a morții celulare imunogene. Aceste observații oferă o explicație pentru motivul pentru care SM crește eficacitatea terapiilor standard prin stimularea sistemului imunitar. În cele din urmă, dovezile că SM poate induce un răspuns inflamator și poate activa sistemul imunitar oferă o interpretare a motivului pentru care SM poate fi mai eficient in vivo decât in vitro, 11, 46 și rezultatele noastre în uciderea celulelor canceroase.