O cromatografie lichidă în tandem; Abordare bazată pe spectrometrie de masă pentru analiza metabolitelor

rezumat

Aici descriem un protocol pentru extracția metaboliților din Staphylococcus aureus și analiza ulterioară a acestora utilizând cromatografia lichidă și spectrometria de masă.

Abstract

Introducere

Agenții patogeni bacterieni se confruntă cu multe provocări în mediul gazdă. În plus față de atacul direct al celulelor imune, gazda secretă, de asemenea, substanțe nutritive importante pentru supraviețuirea și replicarea bacteriilor, generând imunitate nutrițională 1, 2. Pentru a supraviețui acestor medii ostile, agenții patogeni bacterieni implementează factori de virulență. Unii dintre acești factori pot fi folosiți pentru a sustrage răspunsul imun al bacteriilor; Alți factori sunt enzimele digestive, cum ar fi hialuronidaza, termonucleaza și lipaza, care permit bacteriilor să completeze substanțele nutritive care lipsesc din componentele derivate din țesuturi 3, 4, 5. Într-adevăr, bacteriile au dezvoltat sisteme de reglare care leagă starea fiziologică a celulei de producerea factorilor de virulență 6, 7, în sus> 8, 9, 10.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

1. Pregătirea soluțiilor tampon

  1. Se prepară soluție salină tamponată cu fosfat (PBS; pH 7,4) prin diluarea unei soluții stoc de 10 × PBS la o concentrație finală de 1x cu apă ultrapură (distilată și deionizată) cu apă.
  2. Pregătiți soluția de stingere combinând 2 ml acetonitril, 2 ml metanol, 1 ml ultrapur H2O și 19 μl (0,1 mM concentrație finală) acid formic.
  3. Se prepară solventul LC-MS A prin adăugarea de acid formic (0,2% [v/v] concentrație finală) în apă ultrapură.
  4. Se prepară solventul LC-MS B adăugând acid formic (0,2% [v/v] concentrație finală) la acetonitril.
    NOTĂ: Toate soluțiile trebuie realizate cu reactivi de cea mai înaltă puritate disponibili (de obicei clasa CROMATOGRAFIE LICHIDĂ DE PERFORMANȚĂ ÎNALTĂ). Soluțiile trebuie preparate proaspăt înainte de fiecare experiment și depozitate pe gheață înainte de utilizare.

2. Stabilirea creșterii în starea de echilibru a S. aureus

  1. Streak tulpini de S. aureus de interes pentru izolare pe agar de soia triptic (TSA) dintr-o soluție stoc de glicerol congelat. Se incubează la 37 ° C timp de 16-24 ore.
  2. Se inoculează 4 ml bulion de soia triptic (TSB) sau alt mediu adecvat în tuburi de incubare sticlă sterile cu colonii individuale ale fiecărei tulpini. Incubați înclinat (

Unghi de 70 °) cu o rotație la 60 rotații pe minut (rpm) la 37 ° C timp de 16-20 h.
NOTĂ: Culturile peste noapte sunt predispuse la gradienți de oxigen dacă procedurile standard, inclusiv cele descrise în pasul 2.2, afectează fiziologia celulară. Deci, folosim o strategie multiplă de back-dilution pentru a asigura starea biologică de echilibru (a se vedea pașii 2.4-3.2, de mai jos).

  • Utilizați un spectrofotometru pentru a măsura densitatea optică a culturilor de la pasul 2.2 la 600 nm (OD 600). Utilizați mediu steril ca referință optică (gol). Aceste celule sunt diluate la un OD 600 de 0,05 în 50 ml mediu TSB steril (preîncălzit la 37 ° C) în sticle separate DeLong de 250 ml.
  • IncuBeize culturile la 37 ° C într-o baie de apă la 280 rotații pe minut cu agitare.
  • La fiecare 30 de minute, luați măsurători OD 600; pe măsură ce densitățile optice cresc, poate fi necesară diluarea culturilor cu TSB, astfel încât acestea să rămână în intervalul de absorbție liniară a spectrometrului.
  • Dacă culturile de la etapa 2.5 au un OD 600 de

    Ajungeți la 0,8-1,0, subculturați-le în 50 ml 37 ° C pe TSB la un OD600 de 0,01-0,05 și repetați pașii 2.4 și 2.5.

    0,4-0,5, utilizați o pipetă serologică pentru a îndepărta 13 ml de cultură din balon și aplicați proba pe filtre.

  • După ce întreaga probă a fost filtrată, spălați imediat filtrul cu ≥5 ml de metaboliți asociați cu mediu PBS rece cu gheață.
  • Eliberați vidul și folosiți o pereche de pensă sterilă pentru a îndepărta filtrul din frită. Răsturnați filtrul (cu celula în jos) în soluția de răcire pre-răcită.
    NOTĂ: Este important să efectuați pașii de mai sus rapid (adică în câteva secunde) și la fel de repede ca lichidul pentru a asigura îndepărtarea rapidă a celulelor a fost îndepărtat, oprind activitatea metabolică.
  • Incubați filtrele în soluția de stingere pe gheață uscată timp de ≥20 min.
  • Folosind o pensetă sterilă, inversați filtrele (cu celula în sus) în vasul Petri și utilizați o micropipetă pentru a stinge celulele din soluția de stingere pentru a clăti membrana.
  • resuspendați celulele în soluție de stingere și apoi transferați suspensia celulară într-un tub steril rezistent la impact de 2 ml

    100 u L de margele de silice de 0,1 mm. Păstrați-l pe gheață uscată sau la -80 ° C.

    1. Decongelați probele pe gheață umedă și plasați celulele într-un omogenizator cu patru explozii timp de 30 s la 6.000 de rotații pe minut, cu perioade de răcire de 2 minute pe gheață uscată care interferează cu ciclurile.
    2. Clarificați lizatele timp de 15 minute într-o microcentrifugă refrigerată pre-răcită la viteza maximă (adică 18.213 xg la ≤4 ° C).
    3. Transferați supernatantul într-un tub de reacție curat.
    4. Folosind o micropipetă, transferați o porțiune mică a probei într-un tub de microcentrifugă pentru cuantificarea conținutului rezidual de peptide în etapa 6; Salvați restul la -80 ° C.
      NOTĂ: Volumul eșantionului rezervat va varia în funcție de testul BCA din pasul 6.1. Această probă trebuie depozitată pe gheață umedă pentru analiză imediată sau congelată la -80 ° C.

    6. Testul acidului bicinchoninic (BCA)

    1. Efectuați un test BCA, după cum recomandă producătorul kitului, folosind probe de la pasul 5.4 pentru a determina concentrația reziduală de peptide pentru fiecare probă.

    8. Corecția în serie a numărului de ioni

    1. Desemnați fiecare eșantion pentru a servi drept eșantion de referință pentru corectarea lotului (de exemplu, tip sălbatic, replică 1).
    2. Calculați suma numărului de ioni pentru toți metaboliții din proba de referință. Repetați acest calcul pentru toate eșantioanele.
    3. Împărțiți numărul total de ioni ai fiecărei probe la numărul total de ioni ai probei de referință pentru a crea un raport.
    4. Împărțiți numărul de ioni pentru fiecare metabolit dintr-o probă la raportul eșantion/referință pentru a obține un număr de ioni corectat pentru fiecare metabolit.

    1. Împărțiți numărul de ioni corectați în lot pentru fiecare probă obținută în etapa 8 de concentrația peptidică determinată cu testul BCA în etapa 6 pentru a obține o valoare normalizată pentru fiecare metabolit.
      NOTĂ: Numărul de ioni normalizați, lot-lot corecți pentru fiecare metabolit din etapa 9.1 poate fi comparat direct între tulpini și o analiză statistică (de exemplu, un test Mann-Whitney U). Se știe alternativ că un metabolit poate fi neschimbat fie prin tratament, fie fondul genetic poate fi folosit ca dispozitiv de normalizare pentru a detecta modificările prin descompunerea metabolitului. Includerea unei cantități cunoscute de L-norvalină sau acid gluraric în tamponul de extracție poate fi utilizată pentru a corecta pierderea în timpul prelucrării probei 34.

    Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

    Rezultate reprezentative

    Am analizat bazinele de produse metabolice intracelulare în S. aureus în timpul creșterii in vitro într-un mediu bogat complex. Ca dovadă a principiului, am comparat profilurile de metaboliți între osteomielita S. aureus sensibilă la meticilină UAMS-1 izolată (tip sălbatic [WT]) și o tulpină izogenică care nu are regulatorul transcripțional global CodY (Δ codY) 26. Culturile exponențiale în starea de echilibru ale tulpinilor WT și codY au fost stabilite în mediu TSB așa cum este descris în pasul 2 al protocolului. Comportamentul de creștere al culturilor de tip sălbatic și mutant codY-nul a fost similar, cu doar ușoare diferențe în randamentul și rata de creștere (Ilustrația 1). Folosind tehnologia RNA-Seq și microarray, noi și alte gene responsabile pentru enzimele implicate în biosinteza aminoacizilor derivați din aspartat am fost reprimate în codY mutant c-nul comparativ cu celulele WT în timpul - vitro - creștere în TSB (Figura 2) 25, 27, 30. În plus, 30, 35 și brnQ1 și brnQ2, permeazele pentru aminoacizii cu lanț ramificat, sunt supraexprimate în mutantul codY nul.

    Pentru a determina măsura în care abundența intracelulară a stării de echilibru a metaboliților este asociată cu această cale modificată în mutantul nul, efectuăm profilarea metabolitului bazată pe LC-MS. Celulele mutante WT și codY-null au fost crescute la starea de echilibru biologic și au fost scanate așa cum este descris în pasul 4 al protocolului. Am determinat abundența de metaboliți prin intensitatea ionică a zonei de vârf pentru fiecare integrare metabolită rezolvată cromatografic folosind un pachet software analitic (a se vedea lista materialelor) Am corectat diferențele de biomasă normalizate prin abundența de metaboliți a concentrației reziduale de peptide din fiecare probă. De asemenea, am corectat aceste valori pentru posibilele efecte de lot între probele din fiecare probă pentru toți metaboliții, pentru a calcula numărul mediu de ioni și pentru a utiliza proba de tip sălbatic ca valoare de referință. Această abordare a permis comparații între eșantioane ale abundenței de metaboliți în diferite condiții. Comparațiile între metaboliți dintr-o probă dată pot fi realizate în mod similar prin normalizarea abundențelor de metaboliți din numărul de ioni folosind metoda adăugării standard a cantităților molare.

    Am comparat nivelul intermediarilor cheie în calea aspartatului în UAMS-1 și mutantul său codY-nul. Ca în 3 După cum se poate observa, produsele finale ale acestei căi (de exemplu, treonina și (iso) -leucina) sunt abundente în celulele mutante codY - nule, în timp ce precursorii (de exemplu, aspartatul și o acetil homoserina) sunt abundenți în celulele WT. Reglarea ascendentă combinată a BrnQ permite 36 și calea biosintetică a ILV duce probabil la o creștere a izoleucinei și a leucinei 30. Deși diferențele sunt relativ mici (29 determinate prin analiza ARN-Seq, trebuie remarcat și DHP, 2,6-diaminoheptanedioat ( 2,6-diaminopimelat).

    spectrometrie
    Figura 3: Frecvența metaboliților în aspartat - Familia este schimbată într-un mutant codY. Sunt prezentate modificările de 2 ori ale metaboliților selectați în mutantul codY în comparație cu UAMS-1 (WT). Modificarea a fost determinată prin împărțirea frecvenței medii a trei replici ale tulpinei biologice codY-zero la abundența medie a trei replici biologice ale tulpinei WT. Eroarea standard între replicile biologice pentru fiecare metabolit a fost Abonare obligatorie. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

    Discuţie

    1,0, diluat înapoi la un OD 600 de

    0,05, crescute și recoltate atunci când au un OD 600 de

    0,5 atins. O astfel de procedură diluează, de asemenea, moleculele citoplasmatice, inclusiv ARN-urile stabile, acumulând în același timp creșterea peste noapte. Într-adevăr, ARNIII, efectorul sistemului de detectare a agr quorumului, este un astfel de ARN și reglează expresia unora dintre aceleași ținte genetice ca CodY 25, 43, 44. ARN III cumulativ poate masca reglarea dependentă de CodY, ducând la o subestimare a puterii Reprimare sau stimulare de către CodY (Sharma și Brinsmade, rezultate nepublicate).

    O limitare a acestei analize este că oferă o perspectivă momentană asupra abundenței produselor metabolice în interiorul celulei; nu se pot trage concluzii din rezultatele privind modificările fluxului printr-o anumită cale. De exemplu, abundența lizinei și metioninei între cele două tulpini studiate nu se poate schimba, în ciuda dereprimării enzimelor biosintetice din întinderea codY-zero (2 și 3). Tulpina codY-nulă poate produce, de fapt, mai multă lizină și metionină, dar pot fi transformate rapid în alți compuși; astfel încât aceste molecule să nu se acumuleze. Utilizarea unor surse de carbon sau azot marcate cu 13 C sau 15 N ne-ar permite să urmărim scheletele de carbon și azot prin coridoarele metabolice majore 45, 46.

    Am folosit metoda descrisă pentru a explica schimbările în bazinele de metaboliți din S. aureus, B. subtilis 29, Mycobacterium tuberculosis 47 și Enterococcus faecium 48, totuși metoda poate fi aplicată altor bacterii Gram-pozitive și Gram-negative, inclusiv alți agenți patogeni umani ușor de cultivat în laborator. Într-adevăr, integrarea metabolomică și transcriptomică a informațiilor poate dezvălui legături neașteptate între metabolism și virulență, ceea ce ar putea duce la noi strategii de tratare a infecțiilor.

    Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

    Dezvăluiri

    Autorii afirmă că nu au interese financiare.