O metodă bazată pe flotabilitate de determinare a nivelurilor de grăsime în protocolul Drosophila (tradus în germană)
rezumat
Aici vă prezentăm o metodă de măsurare a nivelurilor de grăsime din organism în starea larvară a treia (L3) a stării larvare a Drosophila melanogaster. Această procedură utilizează densitatea relativ scăzută a țesutului adipos pentru a diferenția larvele cu o depozitare de grăsime modificată. Analiza bazată pe flotabilitate este un instrument valoros pentru screening rapid, reproductibil și economic.
Introducere
Procedura se desfășoară după cum urmează folosind diferența de densitate între țesutul adipos și țesutul slab. Țesutul adipos al mamiferelor are o densitate de aproximativ 0,9 g/ml 14, în timp ce mușchiul scheletic are o densitate de 1,06 g/ml 15. Această diferență înseamnă că animalele cu rezerve mai mari de grăsime au o densitate mai mică decât animalele cu rezerve mai mici de grăsime. care le permit să plutească într-o soluție cu o densitate de solid mai bună. Această proprietate permite screeningul extrem de rapid al unui număr mare de animale, fiind în același timp ieftin și neinvaziv. Analiza bazată pe flotabilitate a fost utilizată pentru a confirma atât fenotipurile modificării regulatorilor cunoscuți ai nivelului de grăsime, cât și pentru a identifica noi regulatori genetici și neurologici ai obezității 16,17.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Protocol
1. Colectează ouă din lână cu genotipuri de interes
NOTĂ: Crucile ideale sunt formate din 150 de muște virgine și cel puțin 75 de masculi. Pe colecții ar trebui să existe cel puțin 200 de muște.
2. Transferă larvele în alimente experimentale
- Pregătiți mâncare experimentală.
NOTĂ: Această rețetă de alimente se bazează pe rețeta de mijloc Bloomington Stock 18. Modificări importante, evaluate, includ creșterea cantității de drojdie pentru a optimiza valoarea nutrițională a alimentelor prin cronometrarea etapei de mers (între 112-120 de ore după colectarea ouălor la 25 ° C). Deși am găsit această rețetă ideală pentru sănătatea și dezvoltarea larvelor noastre experimentale, o rețetă alimentară este acceptabilă, având în vedere calibrarea cu controale pozitive și negative, dintre care exemple sunt enumerate la pasul 3.10.- Măsurați 1600 ml de apă distilată.
- Se amestecă 134 g făină de porumb, 10,6 g agar Drosophila tip II și o parte din apă (
500 ml) într-un pahar de 1 l. Se amestecă timp de 2 minute cu un mixer manual de mână. Se amestecă 70 g drojdie uscată vie, 18,4 g făină de soia, 84,8 g extract de malț și o parte din apă (
3. Determinați nivelurile de grăsime din larve
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Rezultate reprezentative
ilustrația 1 arată un exemplu în care testul bazat pe flotabilitate poate detecta atât rezerve de grăsime mai mari, cât și mai mici în larvele modificate genetic. 1A arată că stimularea sau reducerea la tăcere a unui anumit subgrup de neuroni (E347) din creierul larvelor induce depozite mai mici și mai mari de grăsimi. Același control genetic de fond a fost utilizat în ambele cazuri. 1B prezintă un exemplu al modului în care acest fenotip obținut prin analiza densității este confirmat prin extracția neutră a lipidelor și cuantificarea prin GCMS.
ilustrația 1. Funcția neuronală în anumite regiuni ale creierului larvel este necesară și suficientă pentru grăsime corporală - regulament. Activitatea neuronală în linia indicată E347-GAL4 a fost redusă la tăcere prin supraexprimarea Shi DN sau activată prin supraexprimarea NB, așa cum este indicat în panouri, și au fost evaluate efectele asupra grăsimii corporale. (A) Procentul de larve înoată în echilibru în diferite soluții de densitate. Cincizeci de larve au fost examinate pe replicare biologică, n = 7 până la 9 replici biologice pe genotip (B) Procentaj de grăsime corporală (lipide total neutre, inclusiv triacilgliceride și fosfolipide împărțite la greutatea corporală), măsurată prin GCMS 17,20 (n = 8). a controla. Valorile P reprezintă rezultatele testelor t cu două cozi. **** P 16 s-a schimbat. Faceți clic aici pentru a vedea o versiune mai mare a acestei figuri.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Discuţie
Un beneficiu suplimentar al acestei tehnici față de altele este sensibilitatea crescută la modificări mici ale nivelului de grăsime dintr-o populație. Executând un întreg gradient de concentrație într-o populație de 50 de larve, modificări ușoare ale valorilor grăsimii populației sunt identificate printr-o modificare a concentrațiilor medii, deși concentrația larvelor începe să plutească și este completă, poate să nu fie diferită de martori plutit. Această mică schimbare a populației nu poate fi întotdeauna identificată prin alte metode de cuantificare a grăsimilor, deoarece necesită analizarea unui grup mare de larve. Testul densității, pe de altă parte, interogează indivizii din populație și, prin urmare, poate detecta aceste mici modificări sau schimbări în distribuția generală a populației.
Deoarece această tehnică se bazează pe densitatea soluției pentru a produce rezultate fiabile, este extrem de important ca soluțiile de PBS și zaharoză să fie realizate în mod consecvent. Am constatat că diferite rețete PBS produc diferențe în densitatea soluției și duc la rezultate diferite. Vom folosi rețeta prezentată mai sus pentru rezultate consistente. În plus, realizarea 20% zaharozei din același lot de 1x PBS este importantă, deoarece are ca rezultat același fond de densitate a soluției. Dacă cele două soluții ar fi preparate separat, ușoare variații ale densității în PBS ar putea aduce variabile de densitate suplimentare prin adăugarea de zaharoză la flaconul conic experimental. În cele din urmă, evaporarea poate fi o problemă, deoarece în timp, pe măsură ce apa se evaporă, soluțiile vor deveni mai concentrate. Prin urmare, este important să acoperiți bine sticlele și să reproiectați soluția în fiecare săptămână, astfel încât soluțiile experimentale să rămână consistente.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.