O metodă de procesare a imaginii semi-mare și un instrument de vizualizare a datelor pentru a analiza C.

rezumat

Această lucrare descrie un protocol semi-de mare viteză care permite imagistica simultană 3D time-lapse a embriogenezei în embrionii 80–100 C. elegans într-o singură perioadă de noapte. Sunt incluse și instrumente de procesare și vizualizare a imaginilor pentru a optimiza analiza datelor. Combinarea acestor metode cu tulpini de reporter personalizate permite monitorizarea detaliată a embriogenezei.

Abstract

Introducere

Embrionul C. elegans este un sistem model important pentru biologia celulară mecanicistă și analiza specificației destinului celulei și a evenimentelor morfogenetice care determină dezvoltarea embrionară 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. Până în prezent, o mare parte din caracterizarea ambelor evenimente la nivel celular și specificațiile destinului celulei în embrion a fost realizată cu experimente de rezoluție temporală relativ ridicată folosind markeri fluorescenți. În timp ce această abordare funcționează bine pentru evenimente de ordinul secundelor până la zece minute, devine limitată tehnic pentru caracterizarea proceselor mai lungi în ordine de la ore la zile. Dezvoltarea embrionară de la primul decolteu până la sfârșitul întinderii durează aproximativ 10 ore. La acest interval de timp, metodele cu jumătate de flux care ar permite imagistica simultană cu rezoluție de timp mai mică (adică achiziționarea în intervale de timp de 5-20 min) a unor cohorte mai mari de embrioni din diferite condiții ar deschide un nou set de experimente; z. B. Activarea eforturilor sistematice de screening la scară largă și analiza unui număr suficient de embrioni pentru comparații ale consecințelor tulburărilor moleculare.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

1. Pregătiți embrionii C. elegans pentru imagistica cu randament ridicat

NOTĂ: Scopul acestei părți a protocolului este de a crea o populație de embrioni semi-sincronizați (2 până la 8 celule) C. elegans care sunt disecați prin tulpini de marker corespunzătoare (Figura 2) într-o placă de fund de sticlă cu 384 de godeuri pentru imagistică. Alte formate de plăci ar putea funcționa la fel de bine, dar plăcile de 384 de puțuri sunt preferate deoarece dimensiunea mică a puțului limitează răspândirea embrionului într-o zonă relativ mică, făcând mai ușoară identificarea câmpurilor care conțin mai mulți embrioni pentru imagistica în interval de timp. Sincronizarea aproximativă a embrionilor asigură înregistrarea întregului proces de dezvoltare pentru fiecare embrion dintr-un câmp.

2. Scorarea letalității embrionare

Pe baza câmpurilor scanate, letalitatea embrionară și defectele larvare sunt evaluate prin numărarea viermilor eclozați și a embrionilor necloziți pentru fiecare sondă.
Obțineți embrioni necloziți ca fiind embrionari fatali. Excluderea embrionilor arestați cu una până la patru celule din scorul de fatalitate, deoarece embrionii tineri disecați uneori nu reușesc să finalizeze formarea cojii de ou (când meioza II nu este încă completă) și defectele de permeabilitate pot duce la complicații osmotice în primii doi ani. Domenii de afaceri.
Scor viermii parțial eclozați sau complet eclozați cu morfologie corporală sau tulburări de comportament, cum ar fi dumpy sau paralizate, ca „larvă anormală”.

3. Decupare automată (Figura 3A.)

NOTĂ: Software-ul este găzduit în două locații: (1) Zenodo găzduiește o versiune ușor de utilizat a software-ului 12 care nu necesită cunoștințe de programare. (2) Github conține codul sursă pentru software-ul nostru embryoCropUI.py și screenCrop.py 13, care necesită cunoștințe despre Python. Instrucțiuni detaliate despre cum să descărcați și să operați ambele versiuni ale programului sunt date mai jos.

4. Vizualizare (Figura 4)

NOTĂ: OpenandCombine_embsV2.ijm 10, 12 este un macro ImageJ care creează un fișier tiff ușor de recunoscut din toate imaginile pentru o anumită întindere și stare. Este necesară instalarea FIJI/ImageJ 14, 15. Această macrocomandă este executată conform structurii noastre de fișiere. Trebuie modificat pentru a funcționa cu diferite structuri de fișiere. Instrucțiuni privind structura corectă a fișierelor și o descriere detaliată a considerațiilor importante pot fi găsite la sfârșitul fișierului Fișier GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx în depozitul Zenodo. Vă rugăm să citiți complet aceste instrucțiuni înainte de a vizualiza imagini corespunzătoare pentru denumirea și structurarea fișierelor pentru cea mai bună interfață cu această macro. Pentru referință, structura noastră de localizare a fișierelor arată astfel:
Z: -customized, Target'Strain'Emb'Target_Emb'_15 Digit Unique Identifier _W '# F_T' #_ Z '#_ C'.tif
de exemplu. Z: -cropped-EMBD0001-GLS-Emb1-EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

O provocare majoră în caracterizarea efectului tulburărilor moleculare asupra dezvoltării embrionare a C. elegans este că este nevoie de aproximativ 10 ore pentru ca embrionii să progreseze de la primul decolteu până la sfârșitul întinderii la 20 ° 16. O abordare cu jumătate de flux, care permite imagini simultane de cohorte mari de embrioni, este utilă pentru evenimente pe această scală de timp, deoarece permite maparea mai multor condiții în paralel cu o dimensiune de ansamblu suficientă pentru fiecare condiție pentru a permite analiza cantitativă (Figura 1A.).

Figura 2. Tulpini personalizate generate pentru imagistica de înaltă rezoluție a embriogenezei C. eleganserau. (A.) Schemele ilustrează transgenele utilizate pentru a construi tulpinile stratului germinal (sus) și morfogeneza (jos). (B.) Suprafețele de proiecție cu intensitate maximă arată evoluția timpului de dezvoltare în morfogeneza tulpinilor (deasupra) și stratul germinal (deasupra). Vederea ventrală este prezentată așa cum se arată în schemele de circuit (stânga). Timpul este relativ la punctul zecimal (t = 0), care poate fi ușor identificat în ambele tulpini. Bară de scară = 10 m. Figura prin amabilitatea lui Wang și colab. 10 reproduse. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

Figura 3. Programul de decupare personalizat izolează și orientează embrioni individuali din câmpurile de imagistică. (A.) Schema ilustrează funcționalitatea programului de decupare a embrionilor personalizate și evidențiază cele două opțiuni pentru accesarea acestui program: o interfață GUI ușor de utilizat, care nu necesită cunoștințe de programare și se bazează pe Zenodo (stânga) și o versiune de decupare în lot a programului, Python Necesită experiență și este disponibil pe Github (dreapta). (B.) Graficul rezumă algoritmul de decupare automată - o mască binară este generată din imagini cu câmp luminos pe 8 biți și embrioni individuali sunt recunoscuți, decupați și aliniați de-a lungul axei spate din față. Bara de scară este de 10 m. (C.) Schematic descrie procesul utilizat pentru recunoașterea iterativă a embrionilor din masca binară. (D.) Ilustrează schematic metoda de orientare a embrionilor de-a lungul axei anterior-posterioare. Panourile B-D reproduse cu permisiunea lui Wang și colab. 10. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

Figura 4. Macro-ul personalizat ImageJ permite vizualizarea datelor de screening RNAi generând fișiere compozite pentru fiecare condiție. (A.) Sunt afișate embrioni pentru trei exemple de condiții RNAi din setul de teste genetice 40 (a se vedea Wang și colab. 10, 11 pentru setul de date complet) (dreapta), evidențiind diferitele fenotipuri de semnătură care sunt comune fiecăruia și reproductibilitate fenotipurile din fiecare stare. Panoul a fost realizat cu permisiunea lui Wang și colab. 10 adaptate. (B.) Panoul de control ilustrează modul în care macro-ul ImageJ personalizat (OpenandCombine_embsV2.ijm) construiește embrioni dintr-o condiție specifică RNAi într-un fișier compozit ImageJ care setează proiecțiile câmpului luminos și intensitatea maximă pentru fiecare embrion în fiecare moment. Deși este evidențiat un singur exemplu, această macrocomandă poate compila datele pentru multe condiții RNAi în același timp. Macro ImageJ este disponibil pe Zenodo 12. Bară de scară = 10 m. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

Împreună, metoda filmului cu capacitate semi-ridicată, împreună cu instrumentele de decupare a embrionilor și de procesare a imaginilor descrise aici, vor facilita analiza dezvoltării embrionare a C. elegans cu o varietate de mutanți, tulburări și tulpini marker. Un ecran pe scară largă este în prezent în desfășurare în propriul nostru laborator, folosind aceste metode pentru a filma embrioni din cele două tulpini personalizate descrise aici, după ce a fost nevoie de 2.000 de gene pentru a se dezvolta. În cele din urmă, datele din aceste eforturi vor servi ca o altă resursă pentru a spori eforturile de înțelegere a specificației destinului celular și a evenimentelor morfogenetice din timpul embriogenezei.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.