Stéphanie Robert Teză de doctorat în biologia plantelor - PDF Descărcare gratuită
Distragerea dirijată a metabolismului celular în tutunul sălbatic Nicotiana benthamiana utilizată ca gazdă pentru expresia heterologă a proteinelor de interes clinic Teză Stéphanie Robert Doctor în biologie vegetală Doctor în filosofie (dr.) Quebec, Canada Stéphanie Robert, 2015
În cele din urmă, nu în ultimul rând: mulțumesc soțului meu, Stéphane, pentru sprijinul și dragostea sa, în ciuda tuturor acestor seri, nopți și weekenduri de lucru, uneori deznădăjduite, dar care nu cedează niciodată. Stephanie x
Pentru Stéphane și Zachary, xi
Cuprins Rezumat executiv. iii Rezumat. v Cuvânt înainte. vii Mulțumiri. ix Cuprins. xiii Lista tabelelor. xvii Lista figurilor. xix Lista abrevierilor. xxi Introducere generală. 1 Capitolul 1. 3 Revizuirea literaturii. 3 1.1 Producția de proteine recombinante. 5 1.1.1 Sisteme de producție convenționale. 5 1.1.1.1. Bacterii. 5 1.1.1.2 Drojdii. 6 1.1.1.3 Celule animale. 6 1.1.1.4 Ouă. 7 1.1.2 Cultura moleculară a plantelor: o alternativă eficientă pentru producerea de proteine recombinante. 7 1.1.2.1 Transfecția celulelor vegetale. 8 1.1.2.2. Transformare stabilă, expresie tranzitorie. 9 1.2 Proteoliza, adesea un obstacol în calea obținerii de randamente satisfăcătoare în agricultura moleculară a plantelor. 11 1.2.1 Instabilitatea proteinelor recombinante in planta. 11 1.2.2 Senescență și proteoliză. 12 1.3 Strategii pentru protecția proteinelor recombinate în agricultura moleculară a plantelor. 13 1.3.1 Stabilizarea proteinelor recombinante ex planta. 13 1.3.2 Stabilizarea proteinelor recombinante in planta. 14 xiii
4.5.8 Testări de protează. 74 4.5.9 Cuantificare C5-1. 75 4.5.10 Analize statistice. 75 4.6 Rezultate și discuții. 75 4.6.1 MeJA induce o reechilibrare proteomică a frunzelor în N. benthamiana. 75 4.6.2 MeJA are un efect redus asupra interacțiunii N. benthamiana A. tumefaciens. 79 4.6.3 MeJA are de asemenea un efect redus asupra activităților de protează din frunzele transfectate. 80 4.6.4 Tratamentul cu MeJA crește acumularea unei proteine recombinante exprimate tranzitoriu 83. 84 4.7 Concluzii. 85 4.8 Mulțumiri. 86 4.9 Informații de susținere. 86 Capitolul 5. 95 Concluzii și perspective. 95 5.1. Înapoi la ipoteze. 97 5.1.1 Principala ipoteză 1, asupra influenței stadiului de dezvoltare a frunzelor asupra randamentului anticorpului C5-1. 98 5.1.2 Principala ipoteză 2, asupra influenței căilor de apărare a plantei gazdă asupra randamentului anticorpului C5-1. 99 5.2. În concluzie. 101 Referințe. 103 Anexă. 125 Capitolul de carte. 125 xvi
Lista tabelelor Capitolul 3 Tabel 3.1 Randament C5-1 (µg) pe frunză și pe plantă în plantele N. benthamiana exprimând tranzitoriu C5-1 singur sau C5-1 cu SlCys8 sau SlCDI. 48 Tabelul S3.1 Activități proteolitice (unități/sec) în frunze întregi și extracte apoplastice de frunze de N. benthamiana la șase zile după infiltrare cu Agrobacteria care conține un vector gol sau cu Agrobacteria care conține un vector de expresie C5-1 sau neinfiltrat. 57 Capitolul 4 Tabelul 4.1 Proteine legate de stres reglate în sus în frunzele N. benthamiana la 7 zile de tratament după meja. 78 Tabelul S4.1 Complement la Tabelul 1: Peptide unice potrivite pentru proteine reglate prin stres reglate în sus în N. benthamiana lasă 7 d tratament post-meja. 88 Tabelul S4.2 Primeri oligonucleotidici înainte și invers utilizați pentru teste RT PCR în timp real. 93 xvii
Lista figurilor Capitolul 1 Figura 1.1 Reprezentarea schematică a unei plasmide Ti (A), a unui vector binar tipic (B) și a unei plasmide "helper" (C) utilizate pentru transformare. Luat din Pacurar și colab., 2011. 10 Figura 1.2 Stabilizarea lanțurilor ușoare și grele ale anticorpului recombinant C5-1 în frunzele agroinfiltrate ale Nicotianana benthamiana exprimând tranzitoriu SlCDI sau SlCYS9. 18 Figura 1.3 Relația încrucișată între căile metabolice implicate în rezistența sistemică indusă la plante, calea dependentă de acid salicilic (SA) și calea dependentă de acidul jasmonic (JA). 21 Capitolul 3 Figura 3.1 Vectorii binari pentru expresia C5-1, SlCYS8 și SlCDI. 40 Figura 3.2 Caracterizarea biomasei frunzelor N. benthamiana 44 Figura 3.3 Activități proteolitice majore în frunzele N. benthamiana 46 Figura 3.4 Efectul coexprimat SlCYS8 sau SlCDI asupra acumulării C5-1. 49 Figura 3.5 Activitatea biologică a C5-1 exprimată singură sau împreună cu SlCYS8 sau SlCDI . 51 Figura 3.6 Acumularea în timp a C5-1 activ biologic exprimată singură sau împreună cu SlCYS8. 53 Figura S3.1 Nivelurile de activitate ale C5-1 de-a lungul gradientului de vârstă a frunzelor. 58 xix
Lista abrevierilor AACT ADN; ADNc ADNc; ADN T-ADN; ADN T-ADP ANOVA ARN; ARNm ARN; mrna BTH CaMV CHO ELISA EV Fab HC HCl Ig JA LC MeJA MES NaCl nos WHO PBS PCR PDI PR RuBisCO RE; ER RSA α 1 -antichimotripsina acidul dezoxiribonucleic uman; ADN complementar acid dezoxiribonucleic; ADN de transfer ADN complementar; ADN de transfer Adenozin difosfat Analiza varianței; analiza varianței Acidului ribonucleic; ARN mesager al acidului ribonucleic; ARN mesager Benzotiadiazol Conopidă Virus mozaic Celulele ovariilor de hamster chinezesc Test imunosorbent legat de enzime Infiltrare simulată cu un vector gol Fragment care leagă antigenul Lanț greu (lanț greu) Clorură de hidrogen (clorură de hidrogen) Imunoglobulină Acid jasmonic (acid jasmonic) Lanț ușor) Jasonat de metil) Acid 2- [N-morfolino] etansulfonic Clorură de sodiu (clorură de sodiu) Nopalină sintază Organizația Mondială a Sănătății Soluție salină tamponată cu fosfat bisposfat carboxilază/oxigenază Reticul endoplasmatic; reticul endoplasmatic Rezistență sistemică dobândită xxi
RIS Rezistență sistemică indusă SA Acid salicilic (acid salicilic) ScFv Fragment variabil cu un singur lanț SD Deviație standard SDS-PAGE Electroforeză gel dodecil sulfat-poliacrilamidă de sodiu Eroare standard (eroare standard) SlCDI Tomate catepsina D inhibitor; Solanum lycopersicum inhibitor al catepsinei D SlCYS8 A opta subunitate de tomate multicistatină; Solanum lycopersicum multicistatină subunitatea a opta SlCYS9 Tomate cistatină nr. 9; Solanum lycopersicum Cistatina 9 SP Peptidă semnal (peptidă semnal) TEV Virus de gravură a tutunului TMB 3,3,5,5 -tetrametilbenzidină xxii