Studiul senescenței replicative a fibroblastelor dermice canine ca o contribuție la
De la Institutul Anatomic Veterinar al Facultății de Medicină Veterinară din Universitatea din Leipzig Investigația senescenței replicative a fibroblastelor dermice canine ca o contribuție la cercetarea îmbătrânirii Disertație inaugurală pentru obținerea gradului de Doctor medicinae veterinariae (Dr. med.vet.) De către Facultatea de Medicină Veterinară a Universității din Leipzig trimis de Susanne Streit de la Halle/Saale Leipzig, 2006
Cu aprobarea Facultății de Medicină Veterinară a Universității din Leipzig Decan: Prof. Dr. Karsten Fehlhaber Supervizor: Prof. Dr. med. veterinar. habil. Franz-Viktor Salomon Recenzor: 1. Prof. Dr. med. veterinar. habil. Institutul de Anatomie Veterinară Franz-Viktor Salomon, Facultatea de Medicină Veterinară, Universitatea din Leipzig 2. Dr. rer. nat. habil. Ulf Anderegg Departamentul de Dermatologie Experimentală Universitatea Clinica de piele Universitatea Leipzig Leipzig 3. Prof. Dr. Dr. h.c. Wilfried Kraft I. Clinica medicală veterinară, Departamentul de Medicină Veterinară, Universitatea Ludwig Maximilians, Ziua Apărării din München: 19 decembrie 2005
Cuprins 1 Introducere 1 2 Revizuirea literaturii 3 2.1 Îmbătrânire 3 2.1.1 Definiții ale termenului de îmbătrânire 3 2.1.3 Speranța medie și maximă de viață 4 2.1.4 Îmbătrânirea diferitelor specii 4 2.1.5 Speranța de viață a speciilor de câini (Canis familiaris) 6 2.1.6 Efectele îmbătrânirii asupra speciilor de câini 9 2.2 Cercetarea îmbătrânirii 11 2.2.1 Teoriile îmbătrânirii 11 2.2.2 Nivelurile îmbătrânirii conform HAYFLICK (1985) 12 2.2.2.1 Teoriile organelor 12 2.2.2.2 Teoriile fiziologice 12 2.2.2.3 Teoriile bazate pe genom 13 2.2.3 Senescența celulară 14 2.2.4 Utilizarea fibroblastelor pentru experimentele in vitro 17 2.2.5 Comportamentul fibroblastelor in vitro și relația cu durata maximă și medie de viață a unei specii, vârsta donatorului și starea de sănătate a donatorului 17 2.2.6 Determinarea parametrilor replicativului Senescență 20 2.2.7 Câinii în cercetarea îmbătrânirii 21 2.2.8 Extinderea duratei de viață 22 3 Animale, materiale, metode 24 3.1 Animale testate 24 3.2 Materia ramburs 25 3.2.1 Produse chimice utilizate 25 3.2.2 Tampoane și soluții 26 3.3 Metode 27 3.3.1 Cultură celulară 27 3.3.1.1 Material de probă 27 3.3.1.1.1 Colectarea probei 27 3.3.1.1.2 Pregătirea probei 27
3.3.1.2 Cultivarea celulelor 28 3.3.1.2.1 Condițiile de cultivare 28 3.3.1.2.2 Schimbarea mediului 28 3.3.1.2.3 Subcultivarea 28 3.3.1.2.4 Numărarea celulelor și colorarea în albastru tripan 29 3.3.1.2.5 Congelarea celulelor 29 3.3.1.2. 6 Dezghețarea celulelor 29 3.3.1.2.7 Crearea curbelor de creștere 30 3.3.2 Examinări citologice și imunocitochimice 30 3.3.2.1 Colorarea Azan conform Heidenhain 30 3.3.2.2 Colorarea Giemsa 31 3.3.2.3 Detectarea micoplasmei prin analiza fluorescenței 31 3.3.2.4 Imunohistochimie 32 3.3. 3 Documentație fotografică 33 3.3.3.1 Fotografierea celulelor vii 33 3.3.3.2 Fotografierea petelor celulare realizate 34 3.3.3.3 Măsurarea celulelor fotografiate 34 3.3.3.4 Analiza statistică și diagrame 34 3.4 Calcularea parametrilor culturii celulare 34 4 Rezultate 36 4.1 Testele preliminare 36 4.2 Morfologia celule cultivate 37 4.3 Analiza fluorescenței 41 4.4 Imunohistochimie 42 4.5 Parametrii de proliferare a celulelor cultivate 43 4.5.1 Numărul total de celule și vitalitate d culturi de celule 43 4.5.2 Stabilirea proliferării 46 4.5.3 Curbele de creștere 48 5 Discuții 55 5.1 Critica metodologiei 55 5.1.1 Selecția animalelor testate 55 5.1.2 Efectuarea experimentului 57 5.2 Semnificația sistemelor de cultură în general și în special 60
6 Rezumat 72 7 Rezumat 74 8 Bibliografie 76
Lista abrevierilor utilizate complexul ABC BSA CPDL DAB DAPI DMEM DMSO DNA EDTA și colab. FBS GSF HPDL IVL PBS PCR PDL PFA ARN TBS Tris Tris-HCl CNS Complex Streptavidin-Biotin Complex Streptavidin-Biotin Complex Cumulativ Dublarea populației Nivel de dublare 3,3'-Diaminobenzidină-Tetrahidroclorură 4 ', 6-Diamidină-2'-Fenindol-diclorhidroclorură Modificat Eagle Medium Dimethyl sulfoxide acid dezoxiribonucleic, acid dezoxiribonucleic acid etilendiaminetetraacetic și alii și alte centre de cercetare a serului bovin fetal pentru mediu și sănătate în Asociația Helmholtz Cel mai ridicat nivel de dublare a populației Reacție în lanț Populație Nivel de dublare acid paraformaldehidă ribonucleic, acid ribonucleic soluție salină tamponată Tris, soluție salină tamponată Tris Tris (hidroximetil) aminometan Clorhidrat de Tris ser de capră normal
Producția problematică de fibroblaste, cerințele de cultivare reduse și potențialul de diviziune ridicat al acestor celule reprezintă un avantaj considerabil față de alte tipuri de celule (PEACOCKE și colab. 1991, SMITH și colab. 1984). Scopul prezentei lucrări a fost investigarea posibilelor conexiuni între vârsta unui animal și comportamentul proliferativ al celulelor sale (fibroblaste cutanate) (în cadrul rasei de câini Beagle). În acest scop, s-au stabilit culturi de celule primare și secundare de fibroblaste dermice canine de diferite vârste. Parametri precum nivelul de dublare a populației (PDL), nivelul cumulativ de dublare a populației (CPDL), cel mai înalt nivel de dublare a populației (HPDL), timpul de generație și durata de viață in vitro (IVL) descriu potențialul de replicare al celulelor cultivate. Folosind acești parametri, culturile celulare ale animalelor tinere, adulte și bătrâne au fost comparate între ele. Rezultatele acestei lucrări reprezintă o posibilă bază pentru cercetări suplimentare asupra îmbătrânirii celulare la câini cu ajutorul modelelor in vitro