Diferențierea și proliferarea societății Max Planck
Departamentul pentru Dezvoltare și Remodelare a Inimii (Prof. Dr. Dr. Thomas Braun)
MPI pentru cercetarea inimii și a plămânilor, Bad Nauheim
(1) Diferențierea și proliferarea celulelor în timpul dezvoltării și regenerării
Controlul molecular al diferențierii și regenerării în inima deteriorată și îmbătrânită
Conform doctrinei generale, inima adultului este formată din cardiomiocite diferențiate (celule musculare ale inimii) care nu mai sunt capabile să se divizeze. Deoarece inima umană poate funcționa continuu și eficient de-a lungul deceniilor, s-a presupus că cardiomiocitele individuale supraviețuiesc și ele acestei perioade fără modificări majore. Diverse studii au arătat, totuși, că îmbătrânirea și deteriorarea inimii duc inevitabil la pierderea celulelor prin așa-numita moarte celulară programată (apoptoză) cu modificări ulterioare ale țesuturilor (necroză). Din aceasta se poate concluziona că cardiomiocitele adulte au încă o capacitate reziduală de auto-reînnoire și că acest lucru este esențial pentru menținerea funcției cardiace normale. Până în prezent nu se știe ce semnale și procese determină echilibrul dintre moartea celulelor, supraviețuirea celulei și diviziunea celulară.
Un grup de lucru la MPI pentru Cercetarea Inimii și Plămânilor din Bad Nauheim caută factori de creștere care ar putea controla acest echilibru delicat. Unul dintre acești factori este posibil BMP-10, un nou membru al familiei BMP (proteine morfogenetice osoase) care se exprimă în mod specific în bile musculare numite „trabecule” în țesutul cardiac și în atriul inimii de șoarece în curs de dezvoltare. Șoarecii BMP-10 mutanți homozigoti dezvoltă o disfuncție precoce a inimii, care ar putea fi cauzată în special de lipsa de trabeculare, ceea ce duce la moartea embrionilor mutanți între E10,5 și 11,5 p.c. (după copulare) conduce. În cultura țesuturilor, BMP protejează și cardiomiocitele de apoptoză. Deoarece BMP-10 este extrem de exprimat în șoareci și inimi umane adulte, cercetătorii vor analiza rolul BMP-10 în supraviețuirea cardiomiocitelor și îmbătrânirea la modelele de șoarece transgenic. Ei se așteaptă ca o înțelegere mai profundă a rolului BMP să conducă la noi metode terapeutice în bolile de inimă (Fig.1).
Procesele de reparare a inimii îmbătrânite sau deteriorate se caracterizează prin generarea de țesut cicatricial nefuncțional. O regenerare a inimilor îmbătrânite nu este - așa cum s-a explicat mai sus - datorită restricției capacității celulelor musculare cardiace adulte de a se divide și a lipsei cantităților suficiente de celule stem ale inimii. Oamenii de știință de la MPI încearcă, prin urmare, să rupă blocul mitotic al cardiomiocitelor prin manipularea mașinilor celulare. În special, ei investighează rolul factorilor de transcripție E2F și a subunității catalitice a enzimei telomerază în inițierea ciclului celular și utilizarea potențială a versiunilor negative dominante ale p53 și p73 pentru a preveni apoptoza celulelor miocardice.
Cercetători: Izabella Pietrowska, Thomas Kubin, Zhipei Liu
În partea superioară a imaginii este prezentată o inimă de șoarece după ce LAD, un vas coronarian, a fost ligat. Ligarea arterei duce la un atac de cord masiv clar vizibil. În partea de jos a imaginii, un adenovirus a fost injectat în inimă, care exprimă o genă reporter care poate fi făcută vizibilă într-o culoare albastră simplă. Transferul de gene în țesutul cardiac reprezintă o opțiune de tratament viitoare pentru insuficiența cardiacă.
Regenerarea cardiacă a tritonului verde (Notophtalmus viridescens)
Unele organisme au capacitatea de a induce celulele care sunt postmitotice la alte specii să intre din nou în ciclul celular și chiar să regenereze organe întregi sau părți ale organelor. Un membru cunoscut al acestei familii de animale este tritonul Notophtalmus viridescens, care este cunoscut pentru capacitatea sa de a regenera membrele sau cozile amputate și alte structuri. N. viridescens este una dintre puținele vertebrate care este, de asemenea, capabilă să regenereze țesutul muscular cardiac (Fig. 2). O echipă de oameni de știință de la MPI din Bad Nauheim compară profilurile de expresie ale țesutului cardiac nedeteriorat și regenerant pentru a identifica moleculele care controlează capacitatea regenerativă a inimii tritonului. Datele din acest screening sunt comparate cu rezultatele unor ecrane similare ale unui model de șoarece de infarct miocardic. Până în prezent, cercetătorii au generat cipuri de ADN cu 100.000 de ADNc și le-au folosit pentru a identifica gene care prezintă expresie diferențială în inima regeneratoare și în repaus. O analiză funcțională detaliată a căii moleculare care determină regenerarea cardiacă la tritoni este următorul pas, care este în prezent implementat folosind diferite abordări.
Cercetători: Thilo Borchadt, Julia Kruse, Thomas Kubin, Thomas Böttger, Rene Zimmermann
Se arată un „tritoni cu apă roșiatică, verzui” (Notophtalmus viridescens), în care o parte a inimii a fost deteriorată (zona conturată în alb). Celulele musculare cardiace intacte care sunt practic absente în zona afectată au fost colorate în verde. Spre deosebire de oameni, tritonul poate reconstrui zona deteriorată și, la maturitate, o inimă complet normală.
Identificarea genelor care controlează diferențierea cardiomiocitelor
Au fost identificate în trecut diferite gene care contribuie la diferențierea cardiomiocitelor și la morfogeneza inimii. Cu toate acestea, este foarte probabil ca un număr semnificativ mai mare de gene să joace un rol în forma specifică a inimii. Abordări funcționale cuprinzătoare pentru identificarea unor astfel de gene nu există încă pentru mamifere. Un grup de cercetare de la MPI utilizează o strategie de ecran larg a genomului bazată pe diferențierea celulelor stem embrionare. Ea folosește biblioteci complexe de siRNA retrovirale pentru a identifica genele care joacă un rol crucial în diferențierea cardiomiocitelor. Genele identificate sunt utilizate în diferențierea celulelor stem embrionare (celule ES) in vitro prin formarea corpurilor embrionare (EB; Fig 3B) și in vivo folosind himere agregate tetraploidiene.
Cercetător: Andre Schneider, Thomas Böttger, Dietmar von der Ahe
Diferențierea celulelor stem embrionare (ES) în cardiomiocite după tratamentul corpurilor embrionare (EB) cu factorul de creștere FGF-2 timp de trei zile. A: celule nediferențiate; B: Corpuri embrionare după 3 zile de tratament cu FGF-2; C: cardiomiocite pozitive Sarcomere MyHC (MF-20) diferențiate de corpurile embrionare după tratamentul cu 3ng/ml FGF-2.
Îmbătrânirea cardiacă și stresul oxidativ: genele SIR și controlul metabolismului energetic
Speciile reactive de oxigen (ROS = radicali de oxigen) provoacă o multitudine de modificări degenerative în celulă și duc la îmbătrânirea prematură a celulei. În general, acumularea de ROS este considerată a fi principala cauză a îmbătrânirii celulare crescute. Țesuturile care constau în principal din celule postmitotice par a fi deosebit de susceptibile la deteriorarea cauzată de ROS, deoarece au doar un potențial limitat de regenerare. Până în prezent, relațiile exacte dintre stresul oxidativ și îmbătrânire nu sunt pe deplin cunoscute Fig. 4. Este clar, însă, că stresul oxidativ crescut duce la instabilitate în metabolismul energetic. Metabolismul energetic dezechilibrat duce probabil la reducerea activității familiei de gene SIR (regulator de informație tăcut). Genele SIR presupun că inactivează domenii speciale de cromatină (prin deacetilarea histonelor dependente de NAD) și exercită astfel o funcție de protecție. Conform acestei idei, supraexprimarea SIR2 în drojdie (Saccharomyces cervisiae) la o creștere semnificativă a duratei de viață.
Oamenii de știință de la MPI for Heart and Lung Research au generat diverse linii de șoarece care le permit să investigheze rolul stresului oxidativ, al îmbătrânirii și al inactivării cromatinei. În acest scop, au construit o alelă activă condiționată a SOD2 (superoxid dismutază), care permite inactivarea și activarea genei în anumite momente din mușchiul inimii. În a doua serie de experimente, ADNc SIR2 este supraexprimat artificial în inimă. Mai mult, cercetează efectul alimentelor calorice și hipocalorice normale asupra stresului oxidativ și a îmbătrânirii celulare folosind profilurile de expresie corespunzătoare ale cardiomiocitelor. Ei analizează, de asemenea, legătura dintre stresul oxidativ și inactivarea cromatinei genetice prin încrucișarea șoarecilor cu deficit de SOD2 cu cei în care SIR2 este supraexprimat.
Cercetători: Eva Bober, Susanne Weinlich, Olesya Vakrusheva
Enzima „superoxid dismutază manganizată (MnSOD)” crește rata de supraviețuire a fibroblastelor în condiții hiperoxice. Fibroblastele de control și cele care supraexprimă MnSOD au fost cultivate în condiții normale (20% O2 = "normoxie") și hiperoxice (85% O2 = hiperoxie). Imaginile cu contrast de fază documentează o rată de supraviețuire semnificativ mai mare sub stres oxidativ în celulele supraexprimante MnSOD. Supraexprimarea MnSOD poate fi recunoscută prin fluorescența verde (partea stângă și centrul). Partea dreaptă a imaginii: Culoarea albastră documentează senescența indusă (îmbătrânirea) celulelor după administrarea doxorubicinei 200nM. În celulele cu supraexpresie a MnSOD, senescența este în mare parte prevenită.
Controlul migrației celulelor precursoare musculare prin semnale inductive și autonome din celulă
Migrația este o proprietate importantă a celulelor miogene (celule precursoare musculare) în timpul organogenezei și regenerării organelor. În trecut, cercetătorii au putut demonstra că gena Homeobox Lbx1 reglează migrația celulelor precursoare musculare în membre într-o manieră autonomă celulară. Rezultatele lor au dovedit că Lbx1 este un regulator cheie al migrației celulelor precursoare musculare și este necesar pentru migrarea țintită a celulelor precursoare ale mușchilor membrelor posterioare și ale mușchilor extensori ai membrelor anterioare (Fig. 5). Folosind scăderea de ADNc a celulelor Lbx1 mutante heterozigote și homozigote, oamenii de știință au reușit să identifice diferite gene țintă supuse Lbx1. Investigația funcțională a acestor gene este în prezent în desfășurare. Mai mult, grupul de lucru investighează cascadele de transducție a semnalului care sunt necesare pentru mobilitatea celulară și migrația celulelor precursoare musculare la șoareci adulți și embrioni de pui.
Cercetători: Stefan Günther, Svetlana Oustanina
Dezactivarea genei Homeobox Lbx1 duce la oprirea migrării celulelor precursoare musculare în extremități. O genă raportoare bacteriană a fost introdusă în gena Lbx1 prin mutageneză țintită. Acest truc genetic oprește activitatea genei Lbx1 pe de o parte și face celulele vizibile în care Lbx1 ar fi fost prezentă pe de altă parte. Primul și al treilea rând prezintă mutanți homozigoti, al doilea și al patrulea rând mutanți heterozoti. Este clar vizibil în imaginile c și i că celulele precursoare musculare marcate cu albastru nu pot migra în extremitatea posterioară, ci se „blochează” în portbagaj.
Reglarea greutății corporale și a funcției inimii de către genele neuronale bHLH
Ca parte a unui screening pentru gene bHLH exprimate neuronal (factori de transcripție care conțin un domeniu de bază elice-buclă-elice), cercetătorii de la MPI din Bad Nauheim au reușit să identifice un număr de ADNc și gene diferite acum câțiva ani. În special, ei analizează cele două gene NSCL1 și NSCL2. Deși inactivarea NSCL1 nu a dus la nicio disfuncție neuronală vizibilă, șoarecii NSCL1-mutanți mor prematur, probabil ca urmare a unor disfuncții cardiace care pot fi declanșate de disfuncția vegetativă. Șoarecii cu deficit de NSCL2 suferă, de asemenea, de tulburări neuroendocrine multiple (Fig. 6). Inactivarea combinată a ambelor gene duce la reducerea proliferării celulelor nervoase și diferențierea afectată a epiteliului olfactiv.
Cercetătorii sunt interesați de procesele moleculare și fiziologice care stau la baza acestor fenotipuri. O atenție deosebită este acordată analizei genelor țintă NSCL1 și NSCL2 și conexiunii dintre proliferarea și diferențierea celulelor. Unul dintre obiectivele viitoare ale acestui proiect este investigarea funcției NSCL2 în organismul adult și a mecanismului anomaliilor ritmului cardiac și a disfuncțiilor vegetative la mutanții NSCL1.
Cercetător: Karen Ruschke, Thomas Schmidt
Obezitate datorată disfuncției sistemului nervos: Inactivarea țintită a factorului de transcripție de bază helix-loop-helix NSCL-2, care se exprimă în neuroni, duce la obezitate pronunțată la șoareci. Aspectul șoarecelui este similar în semnătura sa moleculară cu sindromul Prader-Willi uman.
(2) Îmbunătățirea și accelerarea regenerării țesuturilor: repararea și înlocuirea inimii și a celulelor musculare scheletice deteriorate
Medicina regenerativă este un domeniu nou și interesant în cercetarea biologică și medicală. Se bazează direct pe rezultatele cercetărilor de bază referitoare la diferențierea și dezvoltarea celulelor. Descoperiri mai recente presupun că deciziile anterioare luate de celule nu sunt ireversibile, dar pot fi inversate și modificate. Un astfel de „concept dinamic de a găsi identitatea” unei celule se bazează pe ideea că menținerea unui fenotip celular necesită o reglare continuă. În principiu, aceasta înseamnă că ar trebui să fie posibilă reprogramarea celulelor diferențiate și astfel consolidarea proprietăților regenerative ale țesuturilor și organelor.
Selectarea și manipularea celulelor stem mezenchimale pentru a genera mioblaste și cardiomiocite
Celulele stem mezenchimale (MSC) apar în stroma (țesutul de susținere) al diferitelor organe. Măduva osoasă conține CSM care pot prelua proprietăți ale diferitelor tipuri de celule, inclusiv mușchii inimii și scheletului și celulele neuroectodermice (Fig. 7). Utilizarea MSC etichetate genetic derivate din măduva osoasă a permis cercetătorilor să obțină o perspectivă asupra potențialului de diferențiere a MSC in vivo care trebuie administrat după injectare în embrioni timpurii de șoarece. Combinând strategii specifice de selecție genetică și protocoale de inducție, a fost posibil să se producă populații de celule relativ uniforme, care au caracteristicile celulelor musculare și care pot fi, dacă este necesar, utilizate în scopuri terapeutice.
Mai mult, grupul lucrează la optimizarea metodelor pentru o selecție eficientă și extinderea MSC pentru generarea de mioblaste și cardiomiocite. De asemenea, ele determină potențialul terapeutic al acestor celule. Cu toate acestea, o astfel de abordare poate avea succes numai dacă este posibil să aflați mai multe despre semnale și procese care sunt necesare pentru determinarea și diferențierea în diferite linii celulare.
Cercetător: Fikru Belema Bedada, Kerstin Broich
Celulele stem mezenchimale par să-și adopte identitatea preferențial prin fuziunea cu celulele musculare scheletice și cardiace existente. Această concluzie rezultă din experimentul prezentat, în care celulele stem mezenchimale au fost marcate cu un colorant roșu și cultivate cu celule musculare de culoare verde peste o membrană cu pori de diferite dimensiuni. Celulele stem mezenchimale ar putea exprima proteine musculare (portocalii) numai dacă dimensiunea porilor filtrului a fost suficientă pentru a permite celulelor să treacă liber. Dacă acest lucru nu ar fi garantat, nu ar putea fi găsite proteine musculare în celulele stem mezenchimale.
Celulele satelit: controlul proliferării, ieșirea ciclului celular și diferențierea în timpul regenerării țesuturilor
Celulele satelit sunt celulele stem ale mușchilor scheletici. Acestea sunt situate între lamina bazală și membrana plasmatică (sarcolema) miotuburilor, unde sunt activate în timpul exercițiului, leziunilor musculare sau bolilor care afectează fibrele musculare. Oamenii de știință analizează mecanismele care controlează proliferarea, ieșirea ciclului celular și diferențierea celulelor satelite în timpul regenerării țesutului muscular (Fig. 8). Prin transplantul de celule marcate genetic de la mutanți de șoarece cu mutații vizate în familia genelor factorului de creștere FGF, au arătat că celulele stem miogene sunt autocrine dependente de FGF. Utilizarea retrovirusurilor negative dominante sugerează că FGF inițiază o cascadă dependentă de ras și ral care inițiază migrarea celulară.
Cercetătorii determină potențialul factorilor de creștere generici și modificați genetic pentru terapia și prevenirea bolilor mușchilor scheletici la animalele transgenice ca model pre-clinic. Sunt utilizate două abordări diferite: 1) generarea de modele animale transgenice pentru analiza funcției factorilor de creștere, în principal FGF, miostatină și SF/HGF; 2) Selectarea factorilor de creștere modificată genetic pe bază de miostatină cu un spectru biologic modificat. Analiza factorilor de creștere în timpul regenerării este susținută de experimente care examinează funcția proceselor autonome celulare în activarea și întreținerea celulelor satelite.
Cercetători: Svetlana Oustanina, Michal Mielcarek, Stefan Günther, André Schneider
Gena pereche Pax7 este responsabilă pentru menținerea bazei de celule stem musculare. Culoarea albastră indică activitatea genei Pax7 în celulele satelit, care sunt situate pe fibrele musculare izolate într-o „poziție satelit”. La mutanții de șoarece Pax7, numărul de celule satelit este redus doar în timpul tinereții șoarecelui (P 11), dar scade rapid odată cu creșterea vârstei (P 60). În plus, celulele satelite mutante Pax7 prezintă o pierdere a expresiei markerului de celule stem CD34.