Disertație pentru obținerea diplomei academice de

Haplotipurile genei receptorului vitaminei D ca factori de susceptibilitate pentru carcinomul colorectal, precum și analiza in vitro a expresiei genelor reglementate de vitamina D Chimie, Farmacie a Universității Libere din Berlin prezentat de Jana Flügge din Greifswald noiembrie 2008 1. Recenzent: Prof. Dr. Matthias F. Melzig Recenzorul 2: Prof. Dr. Disputa Ivar Roots pe 26 februarie 2009

disertație

Mulțumiri testele SNPlex stabilite, efectuate și evaluate. Aș dori în mod special să mulțumesc diplomei Biol, Sabrina Klare pentru realizarea SNPlex, și Dr. Rezolvați Krusekopf pentru stabilirea și evaluarea SNPlex și a doamnei Anne Sülflow și a doamnei diplomate Biol. Kristin Krostitz pentru secvențierea a 3 SNP-uri. Acest doctorat a fost susținut financiar de Ministerul Federal al Educației și Cercetării (proiectul InnoRegio, numărul de grant 03I4507, optimizarea farmacogenomică a terapiei medicamentoase și dezvoltarea de medicamente sub-proiectul carcinomului de colon) și Investitionsbank Berlin (proiectul ProFIT, numărul de grant 1013 3117, factori de risc individuali pentru cancerul de colon, ținând cont de testele de asociere genetică polimorfă inclusiv un număr mare de mutații). Aș dori să-mi exprim mulțumirile speciale părinților mei Dr. Dipl.-Ing. Frank Flügge și Dipl.-Ing. Evelyn Flügge, sora mea Dipl.-Chem. Susanne Flügge, bunica mea Herta Flügge și bunicii mei Günter Buckow și Christel Buckow își exprimă sprijinul valoros pe tot parcursul uceniciei mele, de la școală, prin studii până la doctorat, și pentru sprijinul și încurajarea tuturor urcușurilor și coborâșurilor Loc de munca. II

Cuprins Cuprins Mulțumiri. I Cuprins. III Lista abrevierilor. VII 1 Introducere. 1 1.1 Carcinom colorectal. 1 1.1.1 Incidența și mortalitatea. 1 1.1.2 Patogenia secvenței adenom-carcinom. 1 1.1.3 Factori de risc individuali și de mediu, dispoziție și expunere. 2 1.1.4 Factori genetici și predispoziție. 4 1.2 Vitamina D. 5 1.2.1 Proprietăți. 5 1.2.2 Metabolismul vitaminei D. 6 1.2.3 Relația dintre vitamina D și cancerul colorectal. 7 1.3 Receptorul vitaminei D. 8 1.3.1 Structura, structura și apariția. 8 1.3.2 Mod de operare. 10 1.3.3 Polimorfisme ale genei receptorului vitaminei D, asociații și caracterizare moleculară. 11 1.3.4 Microsatelit poli (A) al receptorului vitaminei D. 12 1.3.5 Polimorfisme ale genelor implicate în metabolismul vitaminei D. 13 1.4 Număr. 14 2 Material și metode. 15 2.1 Materiale. 15 2.1.1 Studiați populațiile. 15 2.1.2 Linii celulare. 18 2.1.3 Dispozitive. 18 2.1.4 Produse chimice. 20 2.1.5 Soluții. 23 2.1.6 Consumabile. 23 III

Cuprins 3 rezultate. 57 3.1 Polimorfisme ale genei VDR. 57 3.1.1 Date clinice. 57 3.1.2 Rezultatele genotipării. 58 3.1.3 Perechi de genotip VDR. 59 3.1.4 Dezechilibru de cuplare VDR. 60 3.1.5 haplotipuri VDR. 61 3.1.6 Receptorul vitaminei D poli (A) microsatelit. 63 3.2 Polimorfisme ale genelor implicate în metabolismul vitaminei D. 67 3.2.1 Date clinice. 67 3.2.2 Rezultatele analizei multiplex. 68 3.2.3 Corelațiile genotipurilor. 72 3.2.4 Analiza cuplajului. 72 3.2.5 Genotipuri și haplotipuri complexe. 74 3.3 Analiza expresiei genelor cu RT-PCR. 77 3.3.1 Experimente de inducție (model de diferențiere). 77 3.3.2 Cuantificarea relativă a mrna. 78 3.3.3 Expresia genei VDR în celulele Caco-2. 79 3.3.4 Expresia genei CDH1 în celulele Caco-2. 80 3.3.5 Expresia genei VDR în celulele SW480. 81 3.3.6 Expresia genei CDH1 în celulele SW480. 82 3.4 Analiza expresiei genelor cu microarrays GeneChip. 83 3.4.1 Analiza cluster. 83 3.4.2 Analiza datelor genelor reglementate (niveluri de securitate). 84 3.4.3 Atribuirea genelor reglementate. 85 3.4.4 Grafic de împrăștiere. 85 3.4.5 Analiza ierarhică a clusterelor. 86 3.4.6 Analiza genelor selectate reglate de vitamina D. 88 4 Discuție. 92 4.1 Polimorfisme ale genei VDR. 92 4.1.1 Influența polimorfismelor genei receptorilor de vitamina D asupra susceptibilității la cancerul colorectal (studiu caz-control). 92 V

Cuprins 4.1.2 Influența dezechilibrului legăturii, genotipurilor complexe și haplotipurilor. 95 4.2 Polimorfisme ale genelor implicate în metabolismul vitaminei D. 100 4.3 Analiza expresiei genelor. 102 4.3.1 Interpretarea rezultatelor analizei expresiei genice cu RT-PCR după inducerea în culturi celulare (model de diferențiere). 102 4.3.2 Probleme tehnice și portabilitate. 104 4.3.3 Alegerea genelor de referință și a celor candidate. 105 4.3.4 Controlul calității și analiza datelor privind rezultatele microarray-ului. 106 4.3.5 VDR și CDH1 expresie după analiza microarray. 106 4.3.6 Interpretarea rezultatelor analizei expresiei genice cu microarray-ul GeneChip. 107 4.3.7 Model de reglare a genei de către vitamina D. 112 4.4 Perspective și perspective. 113 5 Rezumat. 114 6 Bibliografie. 118 7 Lista publicațiilor. 132 CV. 134 Afidavit. 135 VI

Listă de abrevieri Listă de abrevieri Abreviere Acc. Nu. ACTB ATRA β-me bp BMI BSA CDH1 CDS CI crna CV CYP CYP24A1 CYP27A1 CYP27B1 d ddntp DMEM DMSO DNA dntp dsdna EDTA EtOH fcrna FCS Semnificație Număr de acces beta-actin all-trans-retinoic acid beta-mercaptoetanol Indice de masă corporală albumine serice bovine E-cadherină secvență de codificare Interval de încredere ARN complementar Coeficient de variație Citocrom P-450 Citocrom P-450 24A1 (citocrom P450, familia 24, subfamilie A, polipeptidă 1), vitamina -D 3-24-hidroxilază citocrom P-450 27A1 (citocrom P450, familia 27, subfamilie A, polipeptidă 1), vitamina-D 3-25-hidroxilază citocrom P-450 27A1 (citocrom P450, familie 27, subfamilie B, Polipeptida 1), 25-hidroxivitamin-D 3-1-alfa-hidroxilază ziua 2,3 -dideoxinucleotide Dulbecco s Modified Eagle s mediu dimetil sulfoxid acid dezoxiribonucleic dezoxiribonucleotid 5 trifosfat ADN dublu catenar etilen diamină tetraacetat etanol fragmentat m (ser de vițel fetal) VII

Lista abrevierilor g g GAPDH gdna Gl. h hap hm ht HWE cap. kb KG LD M MAF MES mrna mut MW n N.A. NaB NaCl n.d. NR n.s. nt OD OR PBS PCR QC accelerare datorită greutății grame gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază ecuație genomică ADN ecuație oră haplotip omozigot heterozigot echilibru Hardy-Weinberg capitol echilibru perechi kilobază genotipuri complexe cuplare dezechilibru (legătură dezechilibru) alfa minoră frecvența acidului alelei minore (sulfele) ARN (ARN mesager) valoare medie mutată mărimea eșantionului nedeclarată butirat de sodiu clorură de sodiu nedeceptabile receptori nucleari nu nucleotide semnificative densitate optică raport cote fosfat tamponat salină polimerază reacție în lanț controlul calității VIII

Lista abrevierilor r Coeficientul de corelație RAR receptorul acidului retinoic ARN acid ribonucleic restricție RFLP lungime fragment polimorfism tampon RLT, conține rotații rpm pe minut (GITC) rotații rpm pe minut (rotații pe minut) ROH retinol rrna RNA ribosomal RT Svedberg (unitate, coeficient de sedimentare) deviație standard SD (deviație standard) secunde ssdna ADN monocatenar (monocatenar) SNP polimorfism nucleotidic unic Taq Thermus aquaticus TBE tampon Tris-borat-EDTA TE Tris-EDTA tampon Tris Tris- (hidroximetil ) -aminometan trna transfer-ARN U unitate, unitate de lumină ultravioletă UV VDR receptor de vitamina D în greutate tip sălbatic 1α, 25 (OH) 2 D 3 vitamina D, 1,25-dihidroxivitamină D 3, calcitriol 3 -, 5 -UTR 3 -, 5 - regiune netradusă 7-DHC 7-dehidrocolesterol IX

Material și metode furnizate de ggmbh i.gr. Institute, Berlin-Hennigsdorf. O prezentare generală a caracteristicilor tumorale și a clasificării TNM este prezentată în Tabelul 3. Tabelul 3 Localizarea tumorii, histologia tumorii și clasificarea TNM la 452 pacienți cu cancer de colon (grupul II) Localizarea tumorii n% Caecum 32 7.1 Colon ascendent 51 11.3 Colon transvers 26 5.8 Colon descendent 16 3,5 Colon sigmoid 102 22,6 Rect 214 47,3 Altele 11 2.4 Histologie tumorală Adenocarcinom 414 91,6 Adenocarcinom mucinos 28 6,2 Altele 10 2,2 Grad de diferențiere Slab 78 17,2 Moderat 330 73,0 Bun 31 6.9 Nediferențiat 13 2.9 Etapa tumorală (pt) pt1 Submucoasa 22 4.9 pt2 Muscularis propria 109 24.1 pt3 Subserosa 267 59.1 pt4 Alte organe/perforații 54 11.9 Metastaze ale ganglionilor limfatici (pn) pn0 Fără metastaze 211 46,7 pn1 1-3 ganglioni limfatici 126 27,9 pn2 4 sau mai mulți ganglioni limfatici 102 22,5 Altele 13 2,9 Metastaze la distanță (pm) pm0 Fără metastaze la distanță 346 76,6 pm1 Metastaze la distanță 100 22,1 Altele 6 1,3 Grupul de control a constat din pacienți cu non-tumori maligne. Probele au fost colectate de Institutul de Farmacologie Clinică și Toxicologie de la Charité Universitätsmedizin Berlin. Toți participanții la studiu au fost informați despre conținutul și obiectivele studiului și și-au dat acordul scris. 17