Escherichia coli ca medicament probiotic al medicamentelor moleculare și funcționale

Escherichia coli ca ingredient activ probiotic în produse farmaceutice Caracterizarea moleculară și funcțională a tulpinilor care promovează sănătatea DISERTATURA pentru obținerea diplomei universitare Doctor rerum naturalium (Dr. rer.nat.) Al Facultății de Matematică și Științe Naturale a Universității Tehnice din Dresda prezentată de Dipl. Biol. Anke Zschüttig născută la 11.11 .1980 la Dresda, depus la 27 aprilie 2012

Cuprins CUPRINS CUPRINS. O LISTA DE ABREVIERI. E LISTA CIFRELOR. H INDICELE TABELELOR. J 1 INTRODUCERE. 1 1.1 Microflora intestinală umană. 1 1.1.1 Compoziția și funcția florei intestinale. 1 1.1.2 Rolul Escherichia coli. 3 1.2 Tulburări ale florei intestinale și boli. 4 1.3 Probiotice. 6 1.3.1 Definiție, cerințe, exemple. 6 1.3.2 Efecte și mecanisme. 7 1.3.3 Domenii de aplicare. 9 1.3.4 Mutaflor și Escherichia coli Nissle 1917. 10 1.3.5 Probiotice de la SymbioPharm. 10 1.3.5.1 Produsele de la SymbioPharm. 10 1.3.5.2 Symbioflor 2 - compoziție și principii active. 11 1.4 Secvențierea genomului E. coli. 12 1.5 Peptide antimicrobiene din procariote. 13 1.5.1 Definiția și clasificarea bacteriocinelor. 13 1.5.2 Microzine. 15 1.5.3 Domenii de aplicare - prezent și viitor. 18 1.6 Sarcină și obiectiv. 20 2 MATERIAL ȘI METODE. 21 2.1 Materiale. 21 2.1.1 Produse chimice și consumabile utilizate. 21 2.1.2 Kituri utilizate. 21 2.1.3 Tampoane și soluții stoc. 21 2.1.4 Medii de cultură pentru creșterea bacteriilor. 22 2.1.5 Antibiotice. 23 2.1.6 Accesorii pentru cultura celulară. 23 A

Cuprins 2.1.7 Tulpini bacteriene. 24 2.1.8 Plasmide. 25 2.1.9 Oligonucleotide. 26 2.1.10 Enzime. 27 2.1.11 Software. 27 2.2 Metode. 28 2.2.1 Cultivarea celulelor procariote. 28 2.2.1.1 Cultivarea bacteriilor. 28 2.2.1.2 Zootehnie. 28 2.2.1.3 Curbele de creștere. 28 2.2.2 Cultivarea celulelor eucariote. 29 2.2.2.1 Cultura celulară. 29 2.2.2.2 Congelare și decongelare. 29 2.2.3 Experimente de co-cultură cu celule procariote și eucariote. 29 2.2.3.1 Test de aderență. 29 2.2.3.2 Testul invaziei. 31 2.2.3.3 Microscopie confocală. 32 2.2.3.4 Microscopie electronică. 32 2.2.3.5 Testul instanței de inhibiție. 33 2.2.4 Metode biologice moleculare. 33 2.2.4.1 Reacția în lanț a polimerazei (PCR). 33 2.2.4.2 Secvențierea secțiunilor ADN scurte. 35 2.2.4.3 Electroforeză pe gel de agaroză. 36 2.2.4.4 Purificarea ADN-ului. 36 2.2.4.4.1 Purificarea fragmentelor de ADN. 36 2.2.4.4.2 Purificare prin extracție cu gel. 37 2.2.4.4.3 Purificarea reacțiilor de secvențiere. 37 2.2.4.4.4 Precipitații alcoolice. 37 2.2.4.5 Determinarea concentrației ADN-ului. 38 2.2.4.5.1 Măsurarea absorbției. 38 2.2.4.5.2 Determinarea concentrației într-un gel de agaroză. 38 2.2.4.6 Utilizarea endonucleazelor de restricție. 38 2.2.4.7 Defosforilare. 39 2.2.4.8 Legătură. 39 2.2.4.9 Producția de celule competente. 39 2.2.4.10 Electroporare. 40 2.2.4.11 Conjugare. 40 B

Cuprins 3.2.3.3 Escherichia coli G3/10 - detectarea unei peptide antimicrobiene. 86 3.2.4 Detectarea Mikrozin S în Escherichia coli G3/10. 89 3.2.4.1 Analiza codificării operonului pentru Mikrozin S. 89 3.2.4.2 Imunitate la microzină P. 90 3.2.4.3 Depistarea prezenței genei mcss care codifică microzina S în Enterobacteriaceae. 92 3.2.4.4 Detectarea unui efect bactericid al microzinei p. 92 3.2.4.5 Testarea zonei de inhibiție. 94 3.2.4.6 Experimente de coinfecție cu E. coli enterohemoragică. 95 3.2.4.7 Analiza structurii și clasificării proteinelor. 99 4 DISCUȚIE. 103 4.1 Symbioflor 2 E. coli - analiza genomului și probiotice. 103 4.1.1 Genomurile Symbioflor 2 E. coli. 104 4.1.2 Efectul probiotic al Symbioflor 2. 105 4.1.3 Siguranța Symbioflor 2. 106 4.1.4 Comparația Escherichia coli G3/10 cu Escherichia coli Nissle 1917. 109 4.2 Peptide antimicrobiene în Enterobacteriaceae. 111 4.3 Utilizări posibile ale microzinei p. 113 4.3.1 Industria alimentară. 113 4.3.2 Mikrozin S - un nou antibiotic. 115 4.3.3 EHEC - un exemplu de aplicație. 116 5 REZUMAT/REZUMAT. 119 5.1 Rezumat. 119 5.2 Rezumat. 120 6 LITERATURĂ. 123 7 ANEXĂ. 140 PUBLICAȚII. 172 MULȚUMIRI. 174 D

Lista abrevierilor SAP SD SDS Singleton-Gen Sm sp. ssp. ST STEC stx SUE T a TBE TE Tet TNF trna U UE UPEC UV V VTEC ZKBS ZO Creveți fosfatază alcalină deviație standard Genă dodecil sulfat de sodiu specifică pentru un genom Specie de streptomicină Subspecie Toxină stabilă la căldură Shiga care produce toxine Shiga E. coli Toxină Shiga Grave nedorite Temperatura de acumulare a evenimentului Tris-borat-EDTA Tris-EDTA Tumora tetraciclină Transferul factorului de necroză Unități de acid ribonucleic Eveniment advers Uropatogen E. coli Volt ultraviolet Producător de verotoxină E. coli

Lista figurilor Figura 3.31: Screening pentru gena microzin H47 mchb în diferite tulpini EHEC. 99 Figura 3.32: Secvența de aminoacizi a proteinei precursoare Mikrozin S. 99 Figura 3.33: Comparația secvențelor de aminoacizi ale proteinelor precursoare ale microzinelor din clasa IIa. 101 Figura 4.1: Compararea secvenței în regiunea promotoră a operonului glicabd al E. coli G1/2 și E. coli CFT073. 108 Figura 4.2: Componente structurale ale EcN (A) și E. coli G3/10 (B). 110 Figura 7.1: Analiza BLASTp a proteinelor McsA (A) și McsB (B). 164 I.

Introducere 1.5.2 Microzine Termenul microzine a fost introdus în 1976 (Asensio și Perez-Diaz, 1976) pentru a desemna peptide antimicrobiene sintetizate ribozomal cu o masă moleculară mică de 5 kda. Coloana vertebrală a peptidei nu este supusă niciunei modificări. Polipeptidele liniare au un siderofor C-terminal ca modificare post-translațională (Vassiliadis și colab., 2007). Microzinele din clasa IIa sunt de obicei organizate în patru gene codificate pe plasmide cu număr mic de copii. Acestea includ microzinele V (MccV, anterior ColV), L (MccL) și 24 (Mcc24). O proteină de imunitate este codificată în imediata apropiere a microcinei. În plus, se formează două proteine implicate în export. Proteinele de transport din clasa microzincului sunt foarte omoloage. Microzinele în sine au peptide semnal caracteristice. MccV și MccL formează punți disulfură. Spre deosebire de toate microzinele menționate până acum, microzinele din clasa IIb sunt codificate cromozomial. Organizarea genetică este foarte complexă. Tulpina probiotică E. coli Nissle 1917, care formează microzinele M (MccM) și H47 (MccH47) (Patzer și colab., 2003), servește ca exemplu. Regiunea de codificare a microzinului conține gene 17

Materiale și metode psym5 psym6 psym7 psym8 psym9 psym10 psym11 psym12 psym1-st76an Amp R, pilx-conjugation system, mcss, mcsi, mcsa, mcsb this work this work this work this work this work this work this work this work this work this work paz6 Amp R, mcss, mcsi, mcsa, mcsb această lucrare paz8 amp R, mcsi, mcsa, mcsb această lucrare paz9 cm R, mcss această lucrare paz10 cm R, ORF1 această lucrare paz11 cm R, ORF2 această lucrare paz12 cm R, scurtată mcss această lucrare paz13 Amp R, mcsi această lucrare paz14 Amp R, prescurtat mcsi această lucrare paz15 Amp R, PBAD, mcss această lucrare pgs1 Amp R, PBAD această lucrare MCS = Sit de clonare multiplă; ori TS = originea sensibilă la temperatură a replicării; I-SceI = meganuclează; FRT = Ținta de recunoaștere Flippase; FLP = flippase; ORF = cadru de lectură deschis; PBAD = promotor activator arac; Amp = ampicilină; Cm = cloramfenicol; Kana = kanamicină; Tet = tetraciclină. 2.1.9 Oligonucleotide O listă a oligonucleotidelor utilizate de biomeri (Ulm) este prezentată în apendicele din tabelul 7.1 și tabelul 7.2. 26

Rezultate 3 REZULTATE 3.1 Analiza genomului bacterian 3.1.1 Genomul Escherichia coli G3/10 Secvențierea a fost efectuată așa cum este descris în secțiunea 2.2.5.1. Genomul E. coli G3/10 este format din 4.935.403 baze. Conținutul GC este de 50,88%. Adnotarea automată și manuală a identificat 4.844 de gene, 87 de transcrieri trna și 22 transcripții rrna. Genomul în formă circulară este prezentat în Figura 3.1. În timpul adnotării, fiecărei secvențe de codare (CDS) i s-a atribuit un nume, așa-numita etichetă locus, un nume de genă și un produs genetic cu o scurtă descriere. Analizele și comparațiile BLASTn și BLASTp cu intrările din bazele de date relevante (Altschul și colab., 1990) (surse: [5,6]) au servit ca bază pentru aceasta. Cadrele de citire au fost adnotate automat și, dacă este necesar, corectate manual (a se vedea 2.2.5.3). Începutul genomului E. coli G3/10 a fost determinat de gena dnaa. Genomul constă în prezent din patru secțiuni mari cu trei goluri de secvență nedeterminată care nu pot fi închise prin PCR. Secvența completă a genomului va fi accesată în mod liber într-o bază de date după publicare (Zschüttig și colab., Manuscris în pregătire). 51

Rezultate Figura 3.1: Reprezentare circulară a genomului E. coli G3/10. Inelul exterior conține scalarea în kilobaze (kbp). În cel de-al doilea inel, genele firului înainte sunt prezentate în albastru. Inelul 3 prezintă genele genomului nuclear pe care îl conține în negru. Inelul 4 și respectiv inelul 5 prezintă genele catenei complementare în albastru cu genele genomului nuclear în negru. Cele două inele interioare arată conținutul GC (inelul 6) și înclinarea GC (inelul 7), cu ajutorul cărora se poate determina originea replicii orice și terminus terc. Catenă înainte și catenă complementară conțin aproximativ același număr de gene (inelul 2 și 5). Genele genomului nuclear (inelele 3 și 4) sunt distribuite pe ambele fire. Unele zone mai mari care nu conțin gene ale genomului de bază corespund insulelor genomice și regiunilor de profag în care conținutul de GC diferă semnificativ de conținutul mediu de GC al genomului în unele cazuri (inelul 6). Ele sunt adesea asociate cu trnas. CDS = secvențe de codificare. 52

Rezultate E Figura 3.2AE: Reprezentare circulară a genomilor E. coli G1/2 (A), E. coli G4/9 (B), E. coli G5 (C), E. coli G6/7 (D) și E. coli G8 (E). Inelul exterior conține scalarea în kilobaze (kbp). În cel de-al doilea inel, genele firului înainte sunt prezentate în albastru. Inelul 3 prezintă genele genomului nuclear pe care îl conține în negru. Inelul 4 și respectiv inelul 5 prezintă genele catenei complementare în albastru cu genele genomului nuclear în negru. Cele două inele interioare arată conținutul GC (inelul 6) și înclinarea GC (inelul 7), cu ajutorul cărora se poate determina originea replicii orice și terminus terc. Catenă înainte și catenă complementară conțin aproximativ același număr de gene (inelul 2 și 5). Genele genomului nuclear (inelele 3 și 4) sunt distribuite pe ambele fire. Unele zone mai mari care nu conțin gene ale genomului de bază corespund insulelor genomice și regiunilor de profag în care conținutul de GC diferă semnificativ de conținutul mediu de GC al genomului în unele cazuri (inelul 6). Ele sunt adesea asociate cu trnas. CDS = secvențe de codificare. 56

Rezultate genomotipuri E. coli localizate din Symbioflor 2. EcN este considerat deosebit de adaptabil datorită numărului său peste medie de sisteme de absorbție a fierului (Grozdanov și colab., 2004). Genomotipurile E. coli de la Symbioflor 2 poartă unele sisteme de absorbție a fierului și le folosesc pentru a obține avantaje competitive. Cu toate acestea, nu există mai multe sisteme de captare a fierului în aceste E. coli decât în alte tulpini comparabile de E. coli. 3.1.4 Plasmidele Symbioflor 2 E. coli sunt tipuri sălbatice care transportă mai multe plasmide naturale. O imagine de ansamblu a tuturor plasmidelor conținute este prezentată în Figura 3.6 cu ajutorul unei imagini cu gel de agaroză. 62 Figura 3.6: Plasmide în Symbioflor 2 tipuri sălbatice de E. coli. Numerotarea corespunde denumirii plasmidei, de ex. 3 pentru plasmida psym3. * psym1 rulează la nivelul ADN-ului genomic. psym5 și psym6 sunt greu vizibile în imaginea gelului și sunt prezente probabil într-un număr foarte mic de copii. M = dimensiunea standard.

Rezultate Structura inelului a fost închisă manual. Este posibil să fie în număr foarte mic de copii. Figura 3.7: Megaplasmid psym1 de la E. coli G3/10. Cu o lungime de peste 40 kb, plasmida este 99% identică cu pmas2027 din E. coli uropatogen MS2027 (Ong și colab., 2009). În plus, însă, se introduce o zonă de 10 kb (marcată cu albastru) în care este codificată microzina S nou identificată în această lucrare (vezi 3.2.4). Cele două inele exterioare conțin secvențele de codare (CDS) ale firului înainte și invers. Conținutul GC este afișat în negru în al treilea inel. Inelul 4 arată GC-Skew în verde (+) și violet (-). 64

Rezultate ori endo 4000 1800 200 rom/rop 3000 psym2 4197 bps 1000 1400 1600 psym3 1934 bps 400 600 1200 800 2000 1000 csm repa 1200 6000 200 1000 1000 psym4 1304 bps 400 repa 5000 psym5 6567 bps 2000 800 4000 600 3000 ori mobc 10000 4000 8000 psym6 10433 bps 2000 psym7 4452 bps 1000 3000 6000 4000 2000 moba tnpa mobb tnpr mobd Figura 3.8: Hărți plasmidice ale plasmidelor conținute în Symbioflor 2 E. coli cu adnotarea secvențelor de codificare. 65

Rezultate ORF-3 12000 2000 2000 ORF-1 ORF-1 1500 psym8 2353 bps 500 ORF-2 ORF-4 ORF-5 10000 8000 psym9 12686 bps 4000 1000 6000 ORF-8 ORF-2 ORF-7 ORF-6 1400 ori 3000 repa 200 500 1200 psym10 1549 bps 400 2500 psym11 3215 bps 1000 1000 600 2000 800 1500 orit ori mobd/mbkd mobb/mbkb 7000 6000 1000 moba/mbka 5000 psym12 7111 bps 2000 csa mobc/mbkc 4000 3000 oriv csl csi Figura 3.8: Plasmid cards dintre plasmidele conținute în Symbioflor 2 E. coli cu adnotarea secvențelor de codificare. (Continuare). 66

Figura 3.9: Controlul specificității PCR-urilor specifice pentru tulpină și grup dezvoltate pentru E. coli G1/2, G6/7 și G8 (A), E. coli G3/10 (B), E. coli G4/9 (C) și E. coli G5 (D). Benzile rezultate sunt încadrate în roșu. Numerele (#) se referă la colecția principală a grupului de lucru Gunzer. M = dimensiunea standard, NK = control negativ.

Rezultate Tabel 3.5 Prezentare generală a genomurilor Symbioflor 2 E. coli (începând cu ianuarie 2012). Genotip E. coli G1/2 E. coli G3/10 E. coli G4/9 E. coli G5 E. coli G6/7 E. coli G8 Numărul de plasmide Lungimea estimată a cromozomului [bp] 1 Lungimea estimată a genomului [bp] 1.2 Numărul contig 1 Număr estimat de gene 2 Număr de trna 2 4.748.500 4.757.160 36 4.478 82 22 6 4.935.403 5.010.410 4 4.844 87 22 1 4.514.694 4.515.998 29 4.163 72 22 5 4.578.897 4.603.537 43 4.296 84 22 2 4.978.623 4.987.283 41 4.729 81 22 2 4.873.886 4.882.546 62 4.636 73 22 număr rrna 1 Valorile corespund contigurilor atribuite până în prezent. 2 Genomul constă din cromozom plus plasmide. E. coli G4/9 E. coli G5 E. coli G3/10 E. coli G6/7 E. coli G8 E. coli G1/2 Figura 3.10: Compararea genomului Symbioflor 2 E. coli (începând cu ianuarie 2012). Arborele filogenetic a fost generat cu ajutorul EDGAR (Blom și colab., 2009) și pe baza genomului de bază. 70

Rezultate Figura 3.31: Screening pentru gena microzin H47 mchb în diferite tulpini EHEC. Diverse tulpini EHEC, EcN și E. coli G3/10 au fost testate folosind primerii mchb_bamhi și mchb_sphi. Gena microzin H47 a fost detectată în tulpinile EHEC DD, FO1 și FO2. PK = control pozitiv, NK = control negativ. 3.2.4.7 Analiza structurii și clasificării proteinelor Microzin S (MccS) identificat în E. coli G3/10 este o proteină de 120 AA cu o greutate moleculară calculată de 11,67 kda. Termenul microzin a fost introdus pentru a se referi la peptide antibacteriene mici cu greutate moleculară