Influența macrofagelor tisulare asupra bolilor metabolice - PDF Descărcare gratuită
1 Influența macrofagelor tisulare asupra bolilor metabolice TEZĂ DE MASTER pentru obținerea diplomei universitare Master of Science la Universitatea din Hamburg de Științe Aplicate Facultatea de Științe ale Vieții Departamentul de Biotehnologie Prof. Dr. Oliver Ullrich Dr. Andre Broermann trimis de: Christiane Dickel marți, 13 noiembrie 2012
2 Universitatea de Științe Aplicate din Hamburg Facultatea de Științe ale Vieții Departamentul de Biotehnologie Lohbrügger Kirchstrasse Hamburg în cooperare cu: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Birkendorfer Strasse Biberach an der Riss Autor: Christiane Dickel Data depunerii: Primul examinator: Al doilea examinator: Prof. Dr. Oliver Ullrich Dr. Andre Broermann
3 Cuprins 1. Introducere. VI 1.1 Obezitatea și rezistența la insulină. VI 1.2 Perspectiva evolutivă. VIII 1.3 Macrofagele în bolile metabolice. X subtipuri de macrofage. X Migrația transendotelială a macrofagelor. XIII Rolul CCR2 și MCP-1 în recrutarea macrofagelor. XIII 1.4 Markeri de celule albe din sânge pentru analiza FACS. XV 1.5 modele animale. XVI Șoarecele ob/ob. XVI Mouse-ul db/db. XVII mouse-ul DIO. XVII 1.6 Opțiuni de tratament pentru diabetul de tip II. XVIII 1.7 Obiectiv. XXII 2. Materiale și metode. XXIII 2.1 Materiale. XXIII Consumabile. XXIII Echipament utilizat. XXIII substanțe chimice. XXIV anticorpi. XXVI amestecuri de furaje pentru animale. XXVI 2.2 Metode. XXVII preparat tisular. Izolarea celulelor XXVII. Numărul de celule XXVII. XXVII colorare imunofluorescentă. XXVIII Analiza de sortare a celulelor cu fluorescență activată (FACS). XXIX III
4 2.2.6 Evaluare. Testul de toleranță la insulină XXX (ITT). XXXI Test oral de toleranță la glucoză (ogtt). Testul de citokine XXXII. XXXII animale. XXXIII statistici. XXXIII 3. Rezultate. XXXIV 3.1 Stabilirea unei strategii de procesare a țesutului adipos murin, epididimal, pentru analiza FACS a ATM-urilor. XXXIV 3.2 Stabilirea unei metode FACS pentru analiza cantitativă a leucocitelor. Panou tandem XXXV (panou de 4 persoane). Analize XXXV cu colorare de 3 ori. Panou combinat XXXVI (panou de 4). Testul XLI 3.3 al sistemului. Leucocite XLIV într-un model genetic al diabetului. Compararea metodei XLIV. Analiza XLIV cu 3 panouri. Analiza XLVII cu panoul combinat. LI compararea rezultatelor. Leucocite LII într-un model de diabet indus de dietă. LIII 3.4 Studiu subcronic al unui antagonist CCR2 la șoareci huccr2. Leucocite LVI. Concentrația plasmatică LVI a MCP-1. Parametrii metabolici LXII. LXIII 4. Discuție. LXV 4.1 Stabilirea unei analize FACS pentru a cuantifica macrofagele totale și pro-inflamatorii în țesutul adipos murin. Panou tandem LXV. Panou combinat LXV. LXV triplă colorare. Panou LXVI M1/M2. LXVI IV
5 4.2 Compararea metodelor. LXVII 4.3 Modele genetice de mouse. LXVIII 4.4 Modelul obezității induse de dietă (DIO). LXX 4.5 Compararea modelelor de obezitate. LXXI 4.6 Creșterea numărului de ATM la șoarecii obezi. LXXII 4.7 Antagonismul CCR2 ca opțiune terapeutică pentru diabetul de tip II. Numere ATM LXXIII înainte de tratarea substanței. LXXIII Efect antiinflamator al pioglitazonei în modelul DIO. Antagonism LXXIV CCR2 fără efect antiinflamator în țesutul gras testicular. LXXIV Relația dintre inflamația țesutului adipos și parametrii metabolici în acest experiment. LXXV 5. Outlook. LXXVI 6. Rezumat. LXXVII 7. Lista abrevierilor. LXXVIII 8. Lista figurilor. LXXXI 9. Lista tabelelor. LXXXIV 10. Bibliografie. LXXXV 11. Anexă. LXXXIX 11.1 Fișe tehnice pentru amestecuri de alimentare. Foaia de date LXXXIX a hranei pentru fermă. Fișa tehnică LXXXIX a dietei bogate în grăsimi. Fișa tehnică XC a dietei normale. Protocolul XCI 11.2 FACS al Dr. Chavakis la TU Dresda. Afidavit XCII. XCVII mulțumesc. XCVIII V
9 1. Introducere Figura 2: Evoluția țesutului adipos, a ficatului și a sistemului hematopoietic în organele individuale la mamifere În Drosophila melanogaster, țesutul adipos, ficatul și sistemul hematopoietic sunt combinate într-o unitate funcțională numită corp gras. Această origine a dezvoltării se reflectă în structura similară a omologilor la mamifere. Efectele adipocitelor din țesutul adipos și ale hepatocitelor din ficat asupra celulelor imune corespunzătoare, macrofagelor și celulelor Kupffer, sunt foarte similare. În plus, există o legătură strânsă între sistemul imunitar și răspunsurile sistemului metabolic, care se reflectă în accesul direct al celor două țesuturi la rețeaua vaselor de sânge. (Hotamisligil, 2006) 9
10 1. Introducere 1.3 Macrofage în boli metabolice Subtipuri de macrofage În 2003, a fost publicată pentru prima dată o legătură între rezistența la insulină legată de obezitate și inflamația cronică în țesutul adipos, care a fost exprimată sub forma unei acumulări de macrofage în țesutul adipos alb (Weisberg și colab., 2003; Xu și colab., 2003). Macrofagele sunt monocite diferențiate care se dezvoltă din celulele progenitoare ale măduvei spinării. Prin urmare, aparțin celulelor albe din sânge care circulă. Atât monocitele, cât și macrofagele sunt populații de celule eterogene. Inițial au fost definite două subtipuri de macrofage: macrofagele M1 proinflamatorii activate clasic și macrofagele M2 activate alternativ (Gutierrez și colab., 2009; Schipper și colab., 2010). La mamiferele cu greutate normală, leucocitele se găsesc în țesutul adipos, ficat, mușchi și pancreas. Fenotipul lor corespunde cu cel al macrofagelor M2, care sunt implicate în homeostazia tisulară (Lumeng și colab., 2007c; Lumeng și colab., 2008; Odegaard și colab., 2008; Olefsky și Glass, 2010; Lumeng și colab., 2007b). Procedând astfel, ele secretă citokine antiinflamatorii, cum ar fi interleukina (IL) -10, IL-4 și IL-13 (Fig. 3). 10
11 1. Introducere Figura 3: Polarizarea macrofagelor în rezistența la insulină indusă de obezitate în țesutul adipos În condiții normale de greutate, adipocitele secretă factori precum interleukina (IL) -13, care induce activarea alternativă a macrofagelor. Alternativ, macrofagele activate (M2) secretă mediatori antiinflamatori, cum ar fi IL-10. Aceste citokine antiinflamatorii au un efect pozitiv asupra sensibilității la insulină. Obezitatea induce modificări în metabolismul adipocitelor și în expresia genică a citokinelor. Acest lucru duce la creșterea lipolizei și la eliberarea acizilor grași liberi proinflamatori (ffas) și a factorilor care recrutează și activează macrofagele. Astfel de factori sunt proteina chemotactică monocitară-1 (MCP-1) și factorul de necroză tumorală α (TNFα). Macrofagele M1 activate clasic produc cantități mari de mediatori proinflamatori precum TNFα, IL-1β și rezistină, care acționează asupra adipocitelor și astfel induc rezistența la insulină. În acest fel, se stabilește un cerc vicios auto-întăritor care crește și mai mult inflamația și rezistența la insulină. (Olefsky & Glass, 2010; Figura 2, p. 223) 11
23 2. Materiale și metode 2. Materiale și metode 2.1 Materiale Consumabile Descriere Producător #Produs nr. Mănuși de nitril Kimberly-Clark # 90627 Tuburi de microreație eppendorf # Safe Lock Tubes (0,5, 1,5, 2,0 ml) eppendorf # eppendorf # Sfaturi pentru pipetă eppendorf # (20, 200, 1000, 5000 µl) eppendorf # eppendorf # eppendorf # Sfaturi pentru pipete matrice Thermo Scientific # 7281 Pipete de unică folosință rezervor de reactiv costar VWR # Tub de centrifugă (15, 50 ml) greiner # 188271, ml-tuburi BD Falcon # placă de sondă cu fund rotund adânc BD Falcon # Petri Dish BD Falcon # Camere de numărare a celulelor de unică folosință Invrogen # 10283 Testuri de glicemie Smart Swing # 21 Gluko Zellstrayner Fisherbrand # Dispozitive utilizate Denumire Denumire produs Producător Balanță analitică AC211S Sartorius balance A30 Incubator Mettler BBD 6220 Agitator basculant Heraeus PTR-30 Grant-bio Centrifugă refrigerată Heraeus Megafuge 40R Pipete Thermo Scientific 2, 10, 20, 100, 200, 1000, 5000 µl eppendorf
24 2. Materiale și metode Pipete matrice 1250 Matrix Impact 2 Thermo Scientific pentru pipetare ajută la acu-jet MARCA dulapuri de siguranță Hera Safe Thermo Scientific centrifugă de masă 5417C eppendorf Vortexer VF2 Janke & Kunkel contor de celule Contoare invitrogen Fluorescență activată sortare de celule MACS Quant Miltenyi Biotech glucometru în sânge Denumirea produselor chimice Cobas Integra 400 plus Roche Bacillol plus Producător nr. BODE RPMI 1640 cu glutamină Lonza # 4464 Ser fetal bovin Industriile biologice # 04-001AUS-1A Dulbecco s Phophate Buffered Saline Lonza # 6716 Collagenase Sigma # C0130 Trypan blue invitrogen # T10282 Running Buffer MACS Buffer # Storage Solution Buffer # Buffer # Soluție Washing MAC Soluție de înălbitor MACS tampon # clorură de amoniu EDTA Sgima AG Sigma #EG potasiu hidrogen carbonat clorură de sodiu MERCK # clorură de potasiu MERCK # hidrogen fosfat disodic MERCK # sulfat de magneziu MERCK #
25 2. Materiale și metode Clorură de calciu Sigma #CG Dihidrogen fosfat de potasiu MERCK # Hepes Fluka # 54466 Hidrocarbonat de sodiu MERCK # Glucoză Sigma-Aldrich # 15,896-8 Pioglitazonă CCR2 antagonist Takeda produs intern Tampon de hemoliză 150 mm NH 4 Cl 250 µm EDTA 10 mm KH: Soluția 1 (4 ori) 137 mm NaCl 5,36 mm KCl 0,34 mm Na2HPO4 0,81 mm MgSO4 1,26 mm CaCl2 0,44 mm KH2HPO4 Soluția 2 (4 ori) 10 mm Hepes 4,17 mm NaHCO3 1 parte fiecare din soluția 1 și 2 se amestecă cu 2 părți apă dublă distilată și se ajustează la un pH de 7,3 cu NaOH la o temperatură a soluției de 4 C. 25
26 2. Materiale și metode Anticorpi Denumire Producător # Produs nr. PE Rat Anti-Mouse CD45 BD Pharmingen # PE Rat IgG2b, κ Isotype Control BD Pharmingen # APC Rat Anti-Mouse CD11b BD Pharmingen # APC Rat IgG2b, κ Isotype Control BD Pharmingen # PE-Cy 7 Hamster Anti-Mouse CD11c BD Pharmingen # PE-Cy 7 Hamster IgG1, λ1 Isotype Control BD Pharmingen # PE Hamster Anti-Mouse CD11c BD Pharmingen # PE Hamster IgG1, λ1 Isotype Control BD Pharmingen # FITC Hamster Anti-Mouse CD11c BD Pharmingen # FITC Hamster IgG1, λ1 Isotype Control BD Pharmingen # Alexa Fluor 700 Rat Anti-Mouse CD45 BD Pharmingen # Alexa Fluor 700 Rat IgG2b, κ Isotype Control BD Pharmingen # Rat Anti-Mouse F4/80 Antigen: FITC Rat IgG2b Control negativ: FITC AbDserotec # MCA497FB abdserotec # MCA1125FT FC Block Rat Anti -Mouse CD16/CD32 BD Pharmingen # Amestecuri pentru hrana animalelor Păstrarea hranei Kliba Nafag #% kcal dietă bogată în grăsimi Dietele de cercetare # D% kcal Dieta de control Dietele de cercetare # D12450B Fișele tehnice corespunzătoare pentru amestecurile de furaje pot fi găsite în anexă (secțiunea 11.1) 26
31 2. Materiale și metode Calculul unei concentrații de ATM-uri în țesutul adipos: Calculul procentului de macrofage în SVF: Testul de toleranță la insulină (ITT) Testul de toleranță la insulină (ITT) se mai numește testul de hipoglicemie a insulinei și este utilizat pentru a detecta rezistența la insulină. După o injecție de insulină, concentrația zahărului din sânge scade semnificativ într-un corp sănătos. Dacă există rezistență la insulină, scăderea glicemiei ca răspuns la administrarea insulinei este redusă. Animalele sunt postite cu două ore înainte de începerea experimentului. După aceste două ore, imediat înainte de aplicarea insulinei, se ia valoarea postului. Soluția de insulină este administrată i.p. animalelor. aplicat (de ex. 0,5 UI/kg). La 10, 20 și 120 de minute după administrarea insulinei, nivelul zahărului din sânge al animalelor este măsurat cu benzi de măsurare a zahărului din sânge și cu un dispozitiv de măsurare de la Gluko Smart Swing. Acest lucru se face folosind sânge capilar din vârful cozii. 31
33 2. Materiale și metode Animale Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare ale Consiliului regional Tübingen. Șoarecii au fost adăpostiți într-un mediu fără patogeni în cadrul unui ciclu de lumină standard (12 ore lumină/întuneric) cu acces gratuit la apă și alimente. Animalele au fost comandate de la Janvier. În acest proiect a fost utilizată o dietă bogată în grăsimi pentru a induce rezistența la insulină. În acest scop, șoarecilor C57BL/6J li s-a administrat dieta D12451 (20% kcal proteine, 35% kcal carbohidrați, 45% kcal grăsimi) și dieta de control potrivită D12450B (20% kcal proteină, 70% kcal carbohidrați, 10% kcal grăsime) din Research Diets alimentat cu aceeași cantitate de kcal în total Statistici Analiza statistică a fost efectuată cu software-ul Prism Version 5.0 pentru Windows de la Graphpad. Testul t a fost utilizat pentru a compara două grupuri. Pentru o analiză de grup cu mai mult de două grupuri, analiza a fost efectuată folosind ANOVA și testul lui Dunnett. Valorile P de 0,05 au fost considerate semnificative. Semnificația a fost identificată după cum urmează: * corespunde p 0,05, ** corespunde p 0,01 și *** corespunde p 0,
37 3. Rezultate A B C Figura 8: Controlul izotip al panoului macrofagic cu șobolan IgG2b κ-pe, șobolan IgG2b-FITC și șobolan IgG2b κ-apc A În punctul blot al SSC împotriva FSC, este definită o poartă P1 (roșu), care arată SVF. Semnalele B PE și FITC de la această poartă P1 sunt analizate în continuare în dot blot. O populație distinctă care este pozitivă pentru ambele etichete este închisă ca CD45 + F4/80 + (verde). C Aceste celule dublu pozitive sunt reprezentate grafic în funcție de semnalul lor APC în histogramă, iar semnalul pozitiv (roz) descrie macrofagele triple-pozitive ale SVF. Este definită o populație specifică de celule CD45 + F4/80 + (FIG. 7B). Celulele dublu pozitive sunt examinate în canalul APC pentru semnalul pozitiv CD11b specific (FIG. 7C). Aceste celule triplu pozitive sunt macrofage. Controlul izotipului corespunzător arată, așa cum era de așteptat, doar un semnal nespecific foarte scăzut atât pentru punctul PE/FITC dot blot (FIG. 8B), cât și pentru histograma APC (FIG. 8C). 37
39 3. Rezultate ABCD Figura 10: Controlul izotipului panoului macrofagic proinflamator cu șobolan IgG2b κ-PE, șobolan IgG2b κ-apc și hamster IgG1 λ1-fitc A hărți. B Semnalul PE al acestei porți P1 este analizat în continuare în punct blot. Celulele CD45 pozitive (albastre) sunt închise și C afișate în histogramă împotriva semnalului lor APC. Semnalul pozitiv (roz) este apoi închis D în raport cu semnalul FITC. Macrofagele proinflamatorii triple-pozitive ale SVF (verde) pot fi analizate în acest fel. Semnalul PE al anticorpului anti-cd45 prezintă doi nori de puncte care pot fi deosebiți clar unul de celălalt (Fig. 9B). Două vârfuri clar definite pot fi observate și în histograma APC (Fig. 9C). În controlul izotipului, nu există legături nespecifice în niciun canal (FIGURILE 10B și 10C). Cu toate acestea, celulele dublu pozitive prezintă un zgomot ridicat de fundal pentru emisia de fluorescență în canalul FITC (FIG. 9D). Cu toate acestea, toate semnalele nespecifice pot fi excluse prin poarta setată (Fig. 10D). 39
41 3. Rezultate Celulele F4/80 + CD11b + formează o populație distinctă de celule în diagrama FITC/APC (FIG. 11B). Aceste macrofage dublu pozitive formează, de asemenea, un semnal negativ și un semnal pozitiv în histograma PE (FIG. 11C). Atât în poarta macrofagelor, cât și celulele CD11c + închise sunt pentru controlul izotipului fără semnal (Fig. 12B și 12C). Panou combinat (panou de 4) Deoarece o analiză a celor patru markeri celulari dintr-un panou de anticorpi are avantaje mari, cum ar fi un consum mai mic de anticorpi și mai puțin timp decât cu analiza a două colorații de 3 ori ale panourilor de macrofage și macrofage proinflamatorii înseamnă că panoul cu F4/80-FITC, CD11b-APC și CD11c-PE a fost extins cu un anticorp anti-CD45 cu eticheta Alexa Fluor 700. Fig. 13 prezintă spectrul de emisie al celor patru etichete utilizate. Combinarea acestor fluorocromi ar trebui să fie posibilă, deoarece spectrele de emisie nu se suprapun în maximele lor. Figura 13: Spectre de fluorescență ale panoului combinat (panou de 4) cu FITC, PE, APC și Alexa Fluor700 41
42 3. Rezultate Structura de porți rezultată pentru analiza macrofagelor și a macrofagelor proinflamatorii este prezentată mai jos (Fig. 14). Controlul izotipului corespunzător poate fi văzut în Fig. 15. A B C D Figura 14: Porțile panoului anticorpului cu 4 căi cu CD45-Alexa700, F4/80-FITC, CD11b-APC și CD11c-PE A În pata de punct a SSC împotriva FSC, este definită o poartă P1 (roșu), care reprezintă SVF. Semnalele B Alexa Fluor700 și FITC de la această poartă P1 sunt analizate în continuare în dot blot. O populație distinctă care este pozitivă pentru ambele etichete este închisă ca CD45 + F4/80 + (albastru). Aceste celule dublu pozitive sunt reprezentate grafic împotriva semnalului APC în histograma C, iar semnalul pozitiv (roz) reprezintă macrofagele triple-pozitive ale SVF. Aceste macrofage sunt examinate pentru semnalul PE într-o histogramă suplimentară. Macrofagele proinflamatorii CD11c pozitive ale SVF închise prin poarta verde pot fi legate direct de macrofagele SVF ale aceleiași probe într-o singură măsurătoare. 42