Inhibarea expresiei genei ICAM-1 de către oligonucleotide cu triplu helix - Descărcare gratuită PDF
De la Clinica și Policlinica pentru Dermatologie și Alergologie de la Universitatea Ludwig Maximilians din München Director: Prof. Dr. med. Dr. h.c. G. Plewig Inhibarea expresiei genei ICAM-1 prin oligonucleotide cu triplu helix Disertație pentru obținerea titlului de doctor în biologie umană la Facultatea de Medicină a Universității Ludwig Maximilians din München prezentată de Robert Besch de la München 2003
Cu aprobarea Facultății de Medicină a Universității din München Raportor: Prof. Dr. K. Degitz Raportor 2: Prof. Dr. P. B. Becker Co-reporter: Supravegherea de către angajatul doctoratului: Decan: Priv.-Doz. G. Hartmann Prof. Dr. Th. Brocker Dr. C. Mareșal Prof. Dr. Dr. h.c. K. Peter Ziua examenului oral: 28 iulie 2003
Inhibarea expresiei genei ICAM-1 de către oligonucleotide cu triplu helix
Părți ale acestei lucrări fac parte din următoarea publicație: Besch, R., Giovannangeli, C., Kammerbauer, C., Degitz, K. Inhibarea specifică a expresiei ICAM-1 mediată de direcționarea genelor cu oligonucleotide care formează triplex J. Biol. Chem. 2002; 277: 32473-32479
Cuprins INTRODUCERE 1. Descoperirea structurilor triple helix. 1 2. Inhibarea genelor cu oligonucleotide. 2 2.1 Inhibarea genei cu oligonucleotide cu triplu helix. 2 2.2 Inhibarea genelor cu oligonucleotide antisens. 3 3. Structura triplului helix. 4 4. Secvențe țintă pentru oligonucleotide cu triplu helix. 5 5. Oligonucleotide triple helix. 6 5.1 Aspecte fundamentale în proiectarea oligonucleotidelor cu triplu helix 6 5.1.1 Orientarea tripletelor de bază. 6 5.1.2 Unghiuri și lungimi de legătură ale tripletelor de bază. 7 5.1.3 Proprietățile și stabilitatea tripletelor individuale de bază. 8 5.2 Oligonucleotide triple helix. 8 5.2.1 Oligonucleotide triple helix de tip pirimidină. 9 5.2.2 Oligonucleotide cu triplu helix de tip purină. 9 6. Modificări ale oligonucleotidelor triple helix. 10 6.1 Modificări ale bazelor. 10 6.2 Modificări ale coloanei vertebrale. 10 6.3 Modificări ale capetelor. 11 7. Tehnologia triple helix. 13 7.1 Activitatea biologică a oligonucleotidelor cu triplu helix. 13 7.2 Dovezi ale formării triple helix. 14 1 Cuprins
8. Molecule de adeziune celulară. 14 superfamilia imunoglobulinei. 15 integrine. 16 selectine. 16 caderine. 17 9. Molecula de adeziune celulară ICAM-1. 17 9.1 Apariția și reglementarea ICAM-1. 17 9.2 Funcția imunologică a ICAM-1. 18 9.3 Semnificația medicală a inhibării ICAM-1. 19 9.3.1 Boli inflamatorii ale pielii. 20 9.3.2 Alte boli inflamatorii. 21 9.3.3 Apărarea împotriva respingerii organelor transplantate. 21 9.4 Structura proteică a ICAM-1. 22 9.5 Structura genică a ICAM-1. 23 MATERIAL ȘI METODE 1. Materiale. 24 1.1 Produse chimice și solvenți. 24 1.2 Enzime. 25 1.2.1 Enzime de restricție. 25 1.2.2 Alte enzime. 25 1.3 Anticorpi. 25 1.4 Plasmide. 26 1.5 Material biologic. 26 1.5.1 Celule procariote. 26 1.5.2 Celule eucariote. 26 1.6 Medii și aditivi media pentru cultivarea celulelor eucariote. 26 2 Cuprins
1,7 oligonucleotide. 27 1.7.1 Triple helix și oligonucleotide de control. 27 1.7.2 Oligonucleotide utilizate pentru a produce secvențe țintă 27 1.7.3 Oligonucleotide utilizate ca primeri. 28 1.8 Sisteme comerciale complete. 29 1.9 Consumabile. 29 1.10 Dispozitive. 30 1.11 Software. 30 2. Metode. 31 2.1 Tehnici ADN. 31 2.1.1 Manipularea generală a acizilor nucleici. 31 2.1.1.1 Purificarea ADN-ului prin extracție cu fenol. 31 2.1.1.2 Precipitații ADN. 31 2.1.1.3 Electroforeza pe gel cu geluri de agaroză. 31 2.1.1.4 Evaluarea densitometrică a benzilor ADN. 32 2.1.1.5 Izolarea fragmentelor de ADN din gelurile de agaroză. 32 2.1.1.6 Purificarea ADN-ului cu membrane de silicat. 33 2.1.1.7 Determinarea concentrației de acizi nucleici. 33 2.1.2 Pregătirea ADN genomic din celule A431. 33 2.1.2.1 Pregătirea ADN-ului genomic cu coloane de schimb de anioni. 34 2.1.2.2 Pregătirea ADN-ului genomic cu coloane cu membrană de silicat. 34 2.1.3 Reacția în lanț a polimerazei. 35 2.1.4 Etichetarea acizilor nucleici cu digoxigenină (DIG). 36 2.1.4.1 Marcarea internă a acizilor nucleici. 36 2.1.4.2 Marcarea celor 3 capete ale acizilor nucleici. 36 2.1.5 Transferul acizilor nucleici în membranele de nailon (blotare). 37 2.1.6 Hibridizarea ADN-ului cu sonde marcate DIG (Southern blots). 37 2.1.7 Detectarea acizilor nucleici marcati DIG. 37 3 Cuprins
2.5 Dovezi cu triplu helix. 51 2.5.1 Retardarea gelului. 51 2.5.2 Inhibarea enzimelor de restricție. 52 2.5.3 Inhibarea unei reacții PCR. 52 2.5.4 Detectarea triplelor elice prin separare magnetică. 53 2.5.4.1 Detectarea triplului helix pe ADN genomic izolat. 54 2.5.4.2 Detectarea triplului helix în nucleele celulare. 55 REZULTATE 1. Secvențe țintă pentru oligonucleotide cu triplu helix din gena ICAM-1. 56 1.1 Identificarea secvențelor țintă adecvate. 56 1.2 Selectarea secvențelor țintă deosebit de adecvate. 57 2. Proiectarea oligonucleotidelor cu triplu helix. 59 2.1 Oligonucleotide triple helix pentru secvența țintă 13. 59 2.2 Oligonucleotide triple helix pentru secvența țintă 17. 61 2.3 Proiectarea oligonucleotidelor martor. 62 3. Studii de atașament. 63 3.1 Studii de legare cu oligonucleotide triple helix pentru secvența țintă 13. 63 3.1.1 Studii de legare cu secvențe țintă oligonucleotidice. 63 3.1.2 Studii de legare pe plasmidă. 65 3.1.2.1 Producerea plasmidei pcm55 cu secvența țintă 13. 65 3.1.2.2 Detecția triplului helix prin inhibarea EcoN I. 66 3.1.3 Studii de legare pe preparatele ADN genomic. 69 3.1.3.1 Inhibarea enzimei de restricție Bfa I. 69 3.1.3.2 Detecția triplului helix prin separare magnetică. 70 3.1.4 Studii de legare pe preparatele de nucleu celular. 72 3.2 Studii de legare cu oligonucleotide triple helix pentru secvența țintă 17. 76 5 Cuprins
3.2.1 Studii de legare asupra secvențelor țintă oligonucleotidice. 76 3.2.2 Studii de legare pe plasmide. 79 4. Activitatea biologică a oligonucleotidelor cu triplu helix. 81 4.1 Inhibarea expresiei ICAM-1. 81 4.1.1 Stabilirea condițiilor de transfecție pentru oligonucleotide 81 4.1.2 Inhibarea ICAM-1 de către TFO13GT. 82 4.1.3 Inhibarea ICAM-1 de către btfo13cu. 86 4.1.4 Studii privind efectele citotoxice. 87 4.2 Inhibarea genelor reporter. 89 4.2.1 Clonarea plasmidei reporter. 89 4.2.2 Inhibarea expresiei CAT și influența radiației UVA. 92 4.2.3 Investigații suplimentare pentru a demonstra inhibarea genei mediată de tripla helix. 94 DISCUȚIE 1. Capacitatea de legare a oligonucleotidelor cu triplu helix. 96 1.1 Studii pe oligonucleotide care conțin secvențe țintă. 96 1.2 Studii pe plasmide care conțin secvențe țintă. 98 1.3 Studii asupra ADN-ului genomic. 99 2. Inhibarea ICAM-1. 102 3. Activitatea oligonucleotidelor cu triplu helix în sistemul model. 105 4. Influența radiației UVA asupra inhibării genelor cu oligonucleotide cu triplu helix. 106 5. Outlook. 108 REZUMAT. 110 LISTA LITERATURII. 113 ANEXĂ. 126 6 Cuprins
9.5 Structura genică a ICAM-1 Gena ICAM-1 este formată din 7 exoni, care sunt întrerupți de 6 introni (Figura 11). Promotorul Exon Intron 1 2 3 4 5 6 7 1000bp Fig. 11: Gena ICAM-1. Reprezentarea proporțională a genei ICAM-1, cu exoni evidențiați ca niște casete numerotate. Zonele din primul și al doilea intron care nu au fost publicate în momentul scrierii sunt marcate cu bare oblice. Lungimea totală a primului intron este de aproximativ 4 kb, al doilea intron este mai lung de 2,6 kb. Zona tradusă este afișată în zone gri, netraduse, în alb. Cu excepția câtorva suprapuneri minore, fiecare domeniu asemănător imunoglobulinei proteinei este codificat de unul dintre exonii lungi de aproximativ 300 bp (Degitz și colab. 1991). Domeniile extracelulare 1-5 corespund exonilor 2-6, în timp ce partea transmembranară și intracelulară a proteinei este codificată de exonul 7 (Voraberger și colab. 1991). Corelația puternică dintre organizarea genomică și subdivizarea proteinei în domenii este tipică pentru superfamilia imunoglobulinei (Staunton și colab. 1988). 23 Introducere
1.2 Enzime 1.2.1 Enzime de restricție 1.2.2 Alte enzime Denumirea fosfatazei alcaline din creveți Fragment Klenow de ADN polimerază I Pwo-ADN-polimerază (corectură polimerază) T4 ADN ligază Taq-ADN-polimerază Transferază terminală Sursă Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg) MBI Fermentas (St.Leon-Rot) peqlab (Erlangen) Promega (Heidelberg) peqlab (Erlangen) Roche Diagnostics (Mannheim) 1.3 Au fost obținute enzime de restricție a anticorpilor de la Roche Diagnostics (Mannheim), New England Biolabs (Schwalbach), MBI Fermentas (St.Leon-Rot) ) sau obținute de la Hybaid-AGS (Heidelberg). Specificitate Specificitate Etichetare Etichetare Sursă Sursă ICAM-1 Fluorescceină izotiocianat (FITC) MedSystems Diagnostics (Viena, Austria) Uman HLA-DR R-ficoeritrină BD Biosciences (Heidelberg) (PE) Mouse IgG1 Fluoresceină izotiocianat (Unterschleissheim-Lohhof) Beckter Șoarece IgG1 R-Ficoeritrin (PE) BD Biosciences (Heidelberg) 25 Material și metode
1.4 Plasmide Plasmidele inițiale pentru donarea plasmidelor raportoare au fost pcat ™ -Bazic și psv ™ -β-galactozidază Control (Promega, Heidelberg). O plasmidă ADNc ICAM-1 (pg4h1), constând din pgem ™ -4Z (Promega, Heidelberg), în care a fost donat un fragment de 2980 bp din ADNc ICAM-1 folosind EcoR I și Sal I, a venit de la Staunton și al. 1988. 1.5 Material biologic 1.5.1 Celule procariote Escherichia coli (tulpina DH5α) au fost utilizate pentru replicarea plasmidelor. 1.5.2 Celule eucariote Toate experimentele au fost efectuate pe celule A431 obținute de la ATCC (Rockwille, Maryland, SUA). 1.6 Medii și aditivi media pentru cultivarea celulelor eucariote Nume Denumire Amfotericină B Mediul Vulturului Dulbecco (DMEM) Ser de vițel fetal (FCS) Hanks Buffered Saline Solution (HBSS) L-Glutamină Penicilină Streptomicină Tripsină (0,25%)/EDTA (1mM) Technologies (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) ccpro (Neustadt/Weinstrasse) Life Technologies (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) 26 Material și metode
2.2 Oligonucleotide triple helix pentru secvența țintă 17 Pentru secvența țintă 17, au fost dezvoltate oligonucleotide triple helix cu legătură antiparalelă de tip purină. Au constat din guanină și adenină (TFO17GA, Figura 25 A) sau din guanină și timină (TFO17GT, Figura 25 B). O 3'-TEG TFO17GA GGGGGGAAGGGAGGAAG psoralen C6 -5 '5'-CAGTTTTGGGGGGAAGGGAGGAATAAGGCCTC-3' 3'-GTCAAAACCCCCCTTCCCTCCTTATTCCGGAG-5 '3'-TEG B TFO17GT GGGGGGTTGGGTGGTTG psoralen C6 -5', 5'-CAGTTTTGGGGGGAAGGGAGGAATAAGGCCTC-3' 3'-GTCAAAACCCCCCTTCCCTCCTTATTCCGGAG- 5 'Fig. 25: Oligonucleotidele cu triplu helix TFO17GT și TFO17GA. Figura 25 A prezintă TFO17GA, care se leagă anti-paralel cu firul de purină din secvența țintă 17, iar Figura 25 B arată TFO17GT, care se leagă și anti-paralel. Ambele oligonucleotide se leagă de dubla helix cu formarea de legături de hidrogen Hoogsteen inversate. Cele 5 capete au fost modificate cu psoralen, cele 3 capete cu trietilen glicol. Deoarece situsul 5-TpA se află la capătul 3 al segmentului homopurină, psoralenul a fost cuplat la capătul 5 al oligonucleotidei cu triplu helix. Guanina de bază din oligonucleotida cu triplu helix a fost adăugată la capătul 5 pentru a aduce psoralenul într-o poziție adecvată pentru intercalație. Cele 3 capete libere au fost modificate cu trietilen glicol. 61 rezultate
2.3 Proiectarea oligonucleotidelor martor Oligonucleotidele cu o secvență mixtă, care au aceeași lungime și aceeași compoziție de bază ca oligonucleotidele cu triplu helix corespunzătoare (martor amestecat), au servit drept martori. S-a avut grijă ca distribuția bazelor să fie cât mai similară cu oligonucleotidele triple helix asociate. Pentru oligonucleotida cu triplu helix btfo13cu, care se poate lega numai în orientare paralelă, o oligonucleotidă cu o secvență inversată a fost concepută ca un control (3 și 5 capete schimbate). În plus față de aceeași compoziție, oligonucleotidele inversate au, de asemenea, aceeași distribuție a bazelor. Au fost marcate cu inv (pentru inversat). De asemenea, s-a asigurat că modificările oligonucleotidelor martor corespund cu cele ale oligonucleotidelor cu triplu helix. Analog cu oligonucleotidele cu triplu helix, s-a asigurat că oligonucleotidele martor nu erau capabile să hibridizeze cu ARNm ICAM-1 (efecte antisens). Secvența tuturor oligonucleotidelor de control cu oligonucleotidele cu triplu helix corespunzătoare pentru care au fost utilizate este prezentată în secțiunea materiale (Secțiunea 1.7.1, pagina 27). 62 rezultate
Dacă TFO17GA a fost incubat cu plasmida pg4h1 în tampon de incubare (fără potasiu) și iradiat, inhibarea reacției PCR a fost detectabilă dintr-un exces molar de 100 de ori al oligonucleotidei cu triplu helix. O creștere suplimentară a cantității de TFO nu a dus la o inhibare mai mare. Trebuie remarcat faptul că reacția PCR este prevenită numai dacă ambele catene de ADN au fost reticulate (bisaducte), deoarece în cazul monoaductelor catena opusă a amplificării PCR este încă disponibilă. Prin urmare, este puțin probabilă inhibarea completă a PCR a unui amestec de reacție. Dacă incubația a avut loc în tamponul care conține potasiu, s-au observat rezultate similare, inhibarea fiind detectabilă doar dintr-un exces de TFO de 1.000 de ori. Acest rezultat este de asemenea de acord cu formarea redusă a triplului helix în experimentele de întârziere a gelului în prezența potasiului. Reacția PCR nu a fost inhibată fără iradiere. Compararea benzilor de plasmide a arătat că cantitatea de plasmidă utilizată a fost aproximativ aceeași în toate loturile și că diferențele în cantitatea de produs PCR se bazează pe inhibarea PCR și nu pe cantități diferite de plasmidă utilizate. 80 de rezultate
4.1.3 Inhibarea ICAM-1 de către btfo13cu După ce expresia ICAM-1 a fost inhibată de oligonucleotida TFO13GT cu triplu helix de legare antiparalelă, s-au efectuat experimente cu legarea paralelă btfo13cu. Această oligonucleotidă a avut, de asemenea, un efect inhibitor asupra ICAM-1 (Figura 47). ICAM-1 HLA-DR A netratat E netratat B IFNγ F IFNγ C btfo13cu G btfo13cu D bcoinvcu H bcoinvcu Fig. 47: Expresia HLA-DR și expresia ICAM-1 a celulelor A431 după transfecție cu btfo13cu. În stânga, colorarea cu un anticorp anti-ICAM-1 marcat cu FITC, în dreapta, colorarea cu un anticorp anti-HLA-DR conjugat cu PE. Celulele au fost fie netratate (Figura 47 A și E), IFNγ tratate (Figura 47 B și F) sau transfectate înainte de tratamentul IFNγ cu 2 µm btfo13cu (Figura 47 C și G) sau 2 µm bcoinvcu (Figura 47 D și H) fost. 86 rezultate