Leptina influențează rotația celulelor epiteliale intestinale în corelație cu expresia receptorului de leptină

• abstract
• Principal
• MATERIALE SI METODE
• Animale.
• Proiectare experimentală.
• Procedura chirurgicala.
• Parametrii de reglare a intestinului.
• Examen histologic.
• Microdisecție de captare cu laser și pregătire ARN.
• RT-PCR.
• PCR în timp real.
• Proliferarea celulelor criptate și apoptoza enterocitelor.
• Exprimarea genelor Bax și Bcl-2.
• analize statistice.
• REZULTATE
• Parametrii de reglare a intestinului.
• Proliferarea enterocitelor și apoptoza în jejun.
• Formă lungă de expresie LEPr și rotație de enterocite în cripte ileale.
• Formă lungă de exprimare a LEPr și apoptoză enterocitară în vilozitățile ileale.
• Exprimarea genelor legate de apoptoză.
• DISCUŢIE
• glosar

abstract

Studii ample pe diferite modele experimentale ale sindromului intestinului scurt (SBS) au arătat că apoptoza enterocitelor joacă un rol crucial în adaptarea intestinului după rezecție (1, 2). În ciuda necesității hiperplaziei intestinale, stimulii mitotici nu pot suprima moartea celulară programată (3). Mulți cercetători au descris creșterea apoptozei enterocitelor ca un mecanism care compensează creșterea proliferării enterocitelor pentru a obține o nouă rată homeostatică în timpul ajustării intestinului (4). Creșterea apoptozei favorizează eliminarea celulelor stem aberante genetic și previne dezvoltarea tumorii (3, 4).

Adaptarea intestinului după o rezecție intestinală duce la o proliferare crescută a celulelor epiteliale intestinale, precum și la o moarte celulară programată crescută, ceea ce indică o rotație celulară accelerată. Rezultatul acestor acțiuni ajută la remodelarea structurilor villi ale criptei în unități mai alungite și funcțional mai active. Reglarea echilibrului dintre producția celulară și pierderea celulelor prin apoptoză după rezecția intestinului este complexă și factorii exacti care ghidează acest proces de adaptare rămân neclare (11, 12). În special, nu este clar unde acționează mulți dintre acești factori trofici de-a lungul axei criptă-villus. Descoperiri recente sugerează că diferiți factori de creștere, cum ar fi factorul de creștere a keratinocitelor (13) și factorul de creștere epidermică (14), sunt exprimați diferit de-a lungul axei criptă-vilozitate. Acest lucru sugerează că diferiți factori trofici pot acționa în locuri diferite de-a lungul acestei axe. Recent am arătat că TGF-alfa (TGF-α) simulează cifra de afaceri a enterocitelor în funcție de expresia receptorului factorului de creștere epidermică de-a lungul axei villus-criptă (15).

Produsul genetic obez proteic leptina (LEP) este excretat din adipocite și acționează în principal asupra hipotalamusului, care reglează cheltuielile de energie, aportul de alimente și greutatea corporală (16). Deși intestinul nu este un țesut țintă clasic pentru LEP, studii ample în diferite modele experimentale au arătat că LEP determină efecte fiziologice importante asupra creșterii intestinale, maturării și diferențierii celulare (17, 18). În lucrările noastre anterioare, am arătat că LEP stimulează adaptarea intestinului după rezecția masivă a intestinului subțire la un șobolan (19). Cu toate acestea, se știe puțin despre mecanismele din spatele acestui efect pozitiv.

Scopul acestui studiu a fost de a investiga efectele LEP asupra cifrei de afaceri a enterocitelor (proliferare și apoptoză) în legătură cu expresia receptorului LEP (LEPr) de-a lungul axei villus-criptă după rezecția masivă a intestinului subțire la șobolani.

MATERIALE SI METODE

Animale.

Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor al școlii medicale Rappaport (Technion, Haifa, Israel) a aprobat facilitățile și protocoalele pentru animale. Șobolani Sprague-Dawley masculi adulți cu greutatea de 240 până la 260 g au fost adăpostiți în cuști individuale din oțel inoxidabil la temperatură și umiditate constante și s-a menținut un ciclu lumină-întuneric de 12 ore. Șobolanii au fost posti cu acces gratuit la apă timp de 12 ore înainte de experiment. Anestezia generală a fost inițiată cu ketamină (ip 90 mg/kg) și xilazină (ip 15 mg/kg).

Proiectare experimentală.

40 de șobolani au fost repartizați aleatoriu într-unul din cele trei grupuri: grupul A, șobolanii fals au fost supuși unei tranziții intestinale (fals, n = 14); Grupul B, animalele SBS au fost supuse rezecției intestinului (SBS, n = 13); și grupul C, șobolanii SBS-LEP au suferit rezecție intestinală (SBS-LEP, n = 13) și au fost tratați cu LEP la o doză ip de 50 mg/kg de la d 4 la d 14.

Procedura chirurgicala.

Șobolanii au fost supuși uneia dintre cele două proceduri chirurgicale: tranziție intestinală urmată de reanastomoză sau rezecție intestinală de 75%. Folosind tehnici sterile, abdomenul a fost deschis folosind o incizie a liniei medii. La șobolanii fals, intestinul subțire mijlociu a fost tăiat și reasamblat fără rezecția intestinului. O rezecție de 75% a intestinului subțire mediu similar cu cea descrisă anterior a fost efectuată la animalele SBS. Aceasta a constat într-o rezecție a intestinului între 5 cm distal al ligamentului von Treitz și 10 cm proximal al valvei ileocecale. Continuitatea intestinului a fost restabilită prin anastomoză end-to-end folosind suturi absorbabile 6-0 (Vicryl, Ethicon Corporation, SUA). În toate operațiile, cavitatea abdominală a fost închisă în două straturi cu o sutură de 3/0 Vicryl (Ethicon Corporation, SUA). Șobolanilor postoperatori li s-a permis apă ad libitum și o dietă lichidă. Șobolanii au fost sacrificați în ziua 15 prin injectare ip de pentobarbital (75 mg/kg).

Parametrii de reglare a intestinului.

Intestinul subțire a fost îndepărtat rapid, clătit cu soluție salină izotonică rece și împărțit în două segmente: jejunul proximal de anastomoză și ileonul terminal. Intestinul a fost împărțit la marginea antimesenterică, spălat cu soluție salină rece, uscat și fiecare segment a fost cântărit. Mucoasa a fost răzuită din țesutul subiacent cu o spatulă (Sigma Chemical Co., Israel). Probele de mucoasă au fost omogenizate cu reactiv TRIzol. ADN-ul și proteinele au fost extrase prin metoda Chomczynski (20) și exprimate ca micrograme pe centimetru de intestin la 100 de grame de greutate corporală.

Examen histologic.

Secțiunile histologice au fost făcute din jejunul proximal, ileonul distal și site-uri comparabile la animalele de control. Segmentele de intestin subțire au fost fixate în 10% formalină timp de 24 de ore și prelucrate în blocuri standard de parafină. Cinci secțiuni de țesut micronic au fost colorate cu hematoxilină și eozină. Înălțimea Villi și adâncimea criptelor au fost măsurate utilizând software-ul de analiză a imaginii Image Pro Plus 4 (Media Cybernetics, Baltimore, MD). Au fost măsurate zece vilozități și cripte în fiecare secțiune și media înregistrată în micrometri.

Microdisecție cu captare laser și pregătire ARN.

Secțiunile de 15 micrometri grosime au fost montate pe lamele speciale acoperite cu membrană fără RNază și tratate cu UV (PALM Technologies, Bernried, Germania) și fixate imediat în etanol 70% răcit cu gheață timp de 2 minute. După incubare timp de 60 s în acetat de violet crezil 1%, secțiunile au fost deshidratate într-o serie de etanol (70 și 100% pe gheață) și lăsate să se usuce scurt la aer. Diapozitivele au fost depozitate la -80 ° C până la microdisecție. Secțiunile au fost tăiate cu laser în decurs de 3 zile. Diapozitivele au fost observate folosind un microscop cu captură laser Zeiss Axiovert 200 M inversat și vizualizate pe un monitor folosind software-ul PALM Robo. Vârfurile Villi, vilozitățile laterale și criptele au fost separate folosind laserul. ARN-ul a fost extras folosind RNeasy Microkit (Qiagen) și protocolul de microdisecție. Toate probele au fost depozitate la -80 ° C pentru depozitare pe termen lung.

RT-PCR.

Calitatea ARN a fost evaluată cu sistemul automat de electroforeză Experion (BioRad). Cinci micrograme de ARN au fost inversate în ADNc la 37 ° C folosind 200 µM deoxinucleotide (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 5 µM hexamere aleatorii (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), 20 U RNAguard (Amersham Pharmacia Biotech) transcris) și 200 U/μl Moloney mouse leucemia virus transcriptaza inversă (US Biochemicals, Cleveland, OH). Setările ciclotermului au fost optimizate pentru a se asigura că produsele sunt în faza de producție liniară.

PCR în timp real.

Exprimarea formei lungi a nivelurilor LEPr a fost determinată prin PCR cantitativă în timp real pe probele de ADNc folosind kitul TaqMan Assay on Demand (ABsolute Blue QPCR ROX Mix (colorant ROX) de la ABgene, Epsom, Marea Britanie) ABI-PRISM 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Grundurile cu un singur exon (de la PrimerDesing Ltd, Marea Britanie) au fost distanțate la 3’UTR-1064 bp (grund de sens, GCAGGGCTGTATGTCATTGTA; grund antisens, GAACATGGTCCCAAAACAACTT) au fost dezvoltate pentru a produce un amplicon de 109 bp. 18S (5'AGGAATTGACGGAAGGGCAC, 3'GTGCAGCCCCGGACATCTAAG) a fost utilizat pentru a accesa aceeași sarcină ADNc pentru fiecare compartiment. Primerii sunt specifici pentru forma lungă a LEPr și nu se află în același exon; În caz contrar, amplificarea ADN-ului contaminant nu poate fi distinsă de amplificarea ADNc.

Proliferarea celulelor criptate și apoptoza enterocitelor.

Șobolanii au fost injectați cu reactiv de etichetare standard cu 5-bromodeoxiuridină (5-BrdU) (Zymed Lab, Inc, CA) la o doză de 1 ml la 100 g greutate corporală cu 2 ore înainte de sacrificiu. Secțiunile de țesut (5 µm) au fost depărate cu xilen, rehidratate cu alcool gradat și colorate cu un sistem de anticorpi monoclonali anti-BrdU biotinilat utilizând kitul de colorare BrdU (Zymed Lab, Inc, CA). Un indice de proliferare a fost determinat ca raportul dintre celulele criptelor care s-au colorat pozitiv pentru BrdU la 10 cripte.

Încă 5? Secțiunile au fost groase de m pentru a determina gradul de apoptoză a enterocitelor. Imunohistochimia pentru caspază-3 (anticorp policlonal concentrat digerat caspază-3; diluție 1: 100; Biocare Medical, Walnut Creek, CA) a fost efectuată pentru a viza celulele apoptotice utilizând o combinație de metode streptovidin-biotin-peroxidază conform protocoalelor de Identificați producătorul. Expresia apoptozei celulelor epiteliale este exprimată ca numărul total de celule apoptotice de-a lungul acestei axe la 10 villi și 100 de cripte. În unele cazuri, o analiză mai detaliată a localizării apoptozei a fost efectuată folosind tehnici stabilite anterior (21). În acest scop, apoptoza de-a lungul vilozităților a fost diferențiată între treimea inferioară a vilozităților (vilozități laterale) și treimea superioară a vilozităților (vârfurile vilozităților). Apoptoza a fost înregistrată ca număr de celule apoptotice la 10 villi. Un patolog calificat, orb de sursa țesutului intestinal, a efectuat toate măsurătorile.

Exprimarea genelor Bax și Bcl-2.

ARN total a fost izolat din probe de mucoasă înghețate (jejun proximal și ileon distal) folosind reactiv TRIzol (GIBCO BRL, SUA) așa cum este descris de Chomczynski (20). O porțiune din ARN-ul total (2 µg într-un volum total de 25 µl) a fost inversată folosind kitul de sinteză ADNc a ADN-ului Moloney Murine Leusemia Virus (MMLV) (Gene Choice, Inc. Frederick, MD) transcris. După PCR, produsul amplificat (5 pl) a fost rulat pe un gel de agaroză 2% colorat cu bromură de etidiu și fotografiat. Nivelul expresiei genei Bax și Bcl-2 a fost exprimat ca raportul dintre densitatea gri a genei țintă și densitatea gri a 18S în densitometrie. Secvențele pentru genele specifice au fost după cum urmează: Bax 5 'ATGGACGGGTCCGGGGAGCA, 3'ATGGACGGGTCCGGGGAGCA, Bcl-2 5'TGAGGCCCTGTCTGCTTCTG, 3'AGGCTCCCGGGGGCAGTCATGA (toți primerii au fost din concentrații mai mari de 18Sma decât 18Cmma Da. majoritatea ARNm sunt exprimați, primerii ARNr 18S au fost diluați 1:10 pentru a aduce produsele RT-PCR în același interval de amplificare exponențială.

analize statistice.

Datele sunt exprimate ca medie ± SEM. Un test ANOVA unidirecțional, urmat de un test post-hoc Bonferroni, a fost utilizat pentru analiza statistică cu o valoare p

Relația dintre expresia ARNm a receptorului de leptină (B) și proliferarea enterocitelor (A) și apoptoza (C) în cripte după rezecția masivă a intestinului subțire și tratamentul cu leptină. Valorile sunt medii ± SEM. Mărire 1: 100. * p

Efectul rezecției intestinului și a tratamentului cu leptină asupra apoptozei enterocitelor (B) în corelație cu expresia receptorului de leptină (A) în vârfurile vilozităților și în vilozitățile laterale. Valorile sunt medii ± SEM. Mărire 1: 100. * p

Efectul rezecției intestinului și a tratamentului cu leptină asupra expresiei Bax și Bcl-2 în specimenele de mucoasă ileonară. Valorile sunt medii ± SEM. * p. Modificările morfologice includ alungirea vilozităților și aprofundarea criptelor, creșterea proliferării enterocitelor și creșterea migrației enterocitelor de-a lungul vilozităților. Adaptarea funcțională duce la o absorbție crescută de nutrienți de către enterocite izolate (21-23).

Principalul defect al studiului este că sunt analizate doar nivelurile de ARNm din forma lungă a LEPr. Este necesară o experimentare suplimentară pentru a evalua expresia celorlalte forme de LEPr despre care se știe că există în diferite țesuturi de șobolan.

Pe scurt, tratamentul cu LEP stimulează creșterea intestinală la modelele de șobolan de SBS. O expresie crescută a ARNm-ului LEPr de-a lungul axei villus-criptă ar putea indica un rol relevant al LEP în modularea apoptozei enterocitelor din mucoasa gastro-intestinală. Efectul LEP asupra cifrei de afaceri a enterocitelor este puternic corelat cu forma lungă a expresiei LEPr de-a lungul axei vilozitate-criptă.

---