Nucleozomii ca parametri ai morții celulare la pacienții cu tumori maligne - PDF descărcare gratuită
De la Institutul de Chimie Clinică de la Ludwig-Maximilians-Universität München Consiliul de Administrație: Prof. Dr. Dr. h.c. D. Seidel Nucleozomii ca parametri ai morții celulare la pacienții cu tumori maligne Disertație pentru obținerea unui doctorat în medicină la Facultatea de Medicină a Universității Ludwig Maximilians din München prezentată de Stefan Holdenrieder de la Jettingen-Scheppach 24
II Cu aprobarea Facultății de Medicină a Universității din München 1. Reporter: Prof. Dr. Dr. h.c. D. Seidel raportor 2: prof. Dr. C. Nerl Coraportor: Priv. Doza. R. Holle Prof. Dr. J. P. Johnson Co-supraveghere de către angajatul doctor: Dr. Petra Stieber Decan: Prof. Dr. Dr. h.c. K. Peter Ziua examenului oral: 15.1.24
III Dedicat părinților mei
IV Publicații anterioare: Cerere de brevet: Roche Diagnostics, Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, Ready G, Schalhorn A Urmărirea terapiei la pacienții la care apoptoza este indusă ca urmare a bolii sau a terapiei, prin detectarea apoptoticului produse. Număr de brevet: 4918/OA/WO - Ts Articole originale: Holdenrieder S, Stieber P, Förg T, Kühl M, Schulz L, Busch M, Schalhorn A, Seidel D Apoptoza în serul pacienților cu tumori solide Res. 19: 2721-2724 (1999) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Ready G, Fürst H, Schmeller N, Untch M, Seidel D Nucleozomi în ser ca marker pentru moartea celulelor Clin Chem Lab Med 39: 596-65 (21) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, Ready G, Fürst H, Schalhorn A, Schmeller N, Untch M, Seidel D Nucleozomi în serul pacienților cu boli benigne și maligne Int J Cancer (Pred Oncol) 95: 114-12 (21 ) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, v Pawel J, Schalhorn A, Nagel D, Seidel D Nucleozomi circulanți în ser Ann NY Acad Sci 945: 93-12 (21) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, Ready G, Fürst H, Schalhorn A, Schmeller N, Untch M, Seidel D Cuantificarea nucleozomilor în ser prin detectarea morții celulare ELISA plus Biochemica 1 (22): 25-27
VI CONȚINUTUL 1 INTRODUCERE ȘI ÎNTREBAREA I 2 CONTEXT 4 2.1 MOARTEA CELULARĂ 4 2.1.1 ISTORICUL CERCETĂRII MORȚII CELULARE 4 2.1.2 MODUL DE MOARTE DICOTOMICĂ A CELULUI 1 2.1.3 MODEL DE MORȚI CELULARĂ INTEGRATĂ 17 2.1.4 MOARTEA CELULARĂ ÎN PROCESELE FIZIOLOGICE 21 2.1.5 PROCES PROCES 21 6 REGULAREA GENETICĂ A MOARTEI CELULELOR APOPTOTICE 28 2.1.7 CĂILE DE SEMNALIZARE A MOARTEI CELULARE APOPTOTICE 31 2.1.8 INDUCĂTORII MORȚII CELULARE APOPTOTICE 4 2.1.9 METODE DE DETECTARE A MOARTEI CELULARE 43 2.2 NUCLEOZOMI 57 2.2.1 STRUCTURA ȘI FUNCȚIA 2.2 ZUCLEOSOMULUI 2.2.3 CIRCULAREA ACIDELOR NUCLEICE ÎN PLASMĂ ȘI SER 68 3 FONDUL METODOLOGIC AL TESTULUI NUCLEOSOMENT 8 3.1 DETECȚIA IMUNCHIMICĂ ȘI METODE DE MĂSURARE 8 3.2 BAZE METODICE ALE TESTULUI INIȚIAL 82 3.3 MODIFICĂRI ȘI STANDARDIZARE A ANALIZEI 3.4 PACIENTI 92 4.1.1 PERSOANE SĂNĂTOASE 92 4.1.2 PACIENTI CU BOLI DE BENIGNEN 92 4.1.3 PACIENTI CU BOLI DE MALIGNEN 94 4.2 METODE STATISTICE 97 4.2.1 EVALUAREA CALITĂȚII CLINICO-DIAGNOSTICE 97 4.2.2 PROCEDURI STATISTICE ÎN EXAMENELE SECȚIONALE 12 4.2.3 PROCEDURI STATISTICE ÎN LONGITUDINI 13
3 1. Concentrațiile spontane de nucleozomi sunt diferite la persoanele sănătoase, la pacienții cu boli benigne și la pacienții cu tumori maligne? Este posibil să se diagnosticheze boli maligne? 2. Concentrațiile spontane de nucleozomi diferă în diferite tipuri de tumori? 3. Concentrațiile spontane de nucleozomi diferă în ceea ce privește caracteristicile tumorii, cum ar fi stadiul, gradarea sau histologia? 4. Ce modificări ale concentrației de nucleozomi rezultă din operații, infecții și antibioze consecutive, precum și în timpul chimioterapiei și tratamentului radioterapeutic? 5. La persoanele cu boli maligne, modificările concentrației de nucleozomi induse de chimioterapie și radioterapie se corelează cu răspunsul clinic la terapie și cu rezultatele imagistice? Monitorizarea terapeutică poate fi efectuată folosind nucleozomi? Cât de sigur și cât de devreme poate fi evaluată eficiența terapiei? 6. Concentrațiile de nucleozomi în timpul chimioterapiei și radioterapiei se corelează cu alți biomarkeri oncologici utilizați pentru a monitoriza eficacitatea terapiei? Este posibilă o evaluare comparabilă sau mai fiabilă a succesului terapeutic folosind nucleozomi?
6 La începutul anilor 1960, R Lockshin și C Williams au folosit modelul insectelor pentru a studia procesele din timpul morții celulare și au inventat termenul moarte celulară programată ca proces predictibil spațial și temporal (Lockshin 1964). Puțin mai târziu, Tata și Lockshin au arătat că această moarte celulară necesită sinteza macromoleculelor. Au reușit să prevină în mod eficient acest lucru cu inhibitori de ARN și proteine (Tata 1966; Lockshin 1969). În cele din urmă, în 1971, John F. Kerr a descris așa-numita necroză de contracție, o succesiune de modificări pe care le-a observat la celulele individuale, muritoare ale ficatului, care ulterior au devenit atrofiate, după ocluzia venelor portale ale șobolanilor (Kerr 1971). John F. Kerr Andrew Wyllie Sir Alastair Currie Un an mai târziu, împreună cu Andrew Wyllie și Sir Alastair Currie, a introdus termenul de apoptoză, un termen preluat din greacă care denotă căderea frunzelor în toamnă și a anunțat o nouă eră a modernității Cercetarea morții celulare (Kerr 1972). Figurile 2-4 (Cummings 1997): Prima persoană care descrie apoptoza Figurile 5 și 6 (Kerr 1994): Celule apoptotice cu caracteristici morfologice tipice
9 Figura 8: Cronologia cercetării morții celulare
1 2.1.2 Modelul morții celulare dicotomice Din motive istorice, după ce Kerr a introdus termenul de apoptoză, s-a făcut inițial o distincție între tipurile de moarte celulară care rezultă din stimuli externi și interni. Sinuciderea celulară a fost împărțită în cel puțin trei tipuri: moartea celulelor ischemice, moartea celulelor cu radicali liberi și apoptoza reglementată genetic (Majno 1995). După cum a sugerat Gräper, acesta din urmă a constituit contrapartida mitozei. Necroza a fost înțeleasă inițial macroscopic ca fiind reziduurile țesutului mort. La nivel celular, necroza a fost descrisă ca moarte celulară pasivă indusă de stimuli externi, spre deosebire de degradarea celulară intrinsecă, efectuată activ, adică apoptoza. Aceste două forme au fost aplicate într-o manieră dihotomică tuturor fenomenelor de moarte celulară; alte forme de moarte celulară au fost în mare parte ignorate (Wyllie 198a; Kerr 1994). Figura 9: Model clasic de moarte celulară (modificat din Majno 1995): condensarea rupturii cromatinei nucleului celular membrană plasmatică apoptoză intactă deshidratare și contracție a corpului apoptotic celular umflarea celulei și ruperea mitocondriilor necrozei membranei plasmatice
21 2.1.5 Moartea celulară în procesele patologice Moartea celulară și proliferarea celulelor se află într-un echilibru fin reglementat atât în organism, cât și în organe individuale și sisteme funcționale. Dacă acest echilibru este perturbat, bolile se pot dezvolta la toate nivelurile: Homeostazie Moartea celulară Proliferarea O predominanță a ratei de proliferare peste rata mortalității celulare poate duce la boli maligne locale și sistemice, precum și la boli metabolice, inflamatorii și unele autoimune. Boli hiperproliferative Moartea celulară Proliferarea Moartea excesivă a celulelor, pe de altă parte, stă la baza dezvoltării unui număr mare de boli degenerative, hematologice, autoimune, legate de ischemie, mediate de toxine și inflamatorii. Bolile degenerative și distructive Proliferarea Moartea celulară O imagine de ansamblu asupra importanței morții celulare în diferite boli este compilată în tabelul următor (Thompson 1995; Fadeel 1999; Robertson 22):
Reglarea căilor de semnal Pentru inițierea și implementarea apoptozei mediată de receptor, au fost identificate câteva căi centrale de transmitere a semnalului care sunt comune tuturor celulelor și au fost descrise câteva secțiuni variabile, în funcție de tipul celulei și de agentul declanșator. Factorii comuni includ formarea DISC-ului din receptorii trimerizați, FADD și inițiatorul procaspaza 8, precum și segmentul final al caspazelor efectoare, în special caspaza 3, care duce la activarea structurii celulare și a proteazelor care scindează nucleul. Între acestea există trei secțiuni variabile: 1. activarea directă a cascadei caspazei 2. implicarea mitocondriilor cu eliberarea citocromului C 3. activarea mitocondriilor și eliberarea AIF în funcție de calea pe care o puteți lua pentru a efectua apoptoza se pot distinge două tipuri de celule (Scaffidi 1998; Krammer 2a, b): CD95-L CD95-R Figura 18: Căi de semnalizare apoptotice în celulele de tip I și tip II (modificate de la Krammer 2a) FADD/MORT1 DD DD DD DD DD DD DD FADD Pro - CASP-8 DISC c-flip BID Bcl-2 Bcl-x L CASP-8 Cyto c - Apaf-1 CASP-3 CASP-9 CASP-8 AIF Substraturi de deces TIP I Apoptoză TIP II
39 Numeroși inhibitori ai caspazelor efectoare sunt grupați împreună ca IAP (inhibitori ai apoptozei). În celulele umane, acestea includ XIAP (MIHA), c-iap-1 (MIHB), c-iap-2 (MIHC), NAIP și survivin. Acestea încep de la caspazele 3 și 7 activate și de la apoptozom și diferă semnificativ în ceea ce privește potența lor inhibitoare. (Cecconi 1999; Budjhardjo 1999, Thornberry 1998; Jäättelä 1999; Deveraux 1999; Goyal 21). Importanța lor stă probabil în reglarea fină a semnalului de apoptoză. Acest lucru este, de asemenea, susținut de eliberarea de proteine suplimentare care reglează IAP, cum ar fi Smac (al doilea activator derivat din mitocondrie al caspazelor) și DIABLO (proteină directă de legare a IAP cu pi scăzut) (Hengartner 2) în timpul apoptozei. Cele mai importante componente ale căilor de semnal de apoptoză, inclusiv punctele de plecare inhibitoare, sunt ilustrate mai jos: FADD/MORT1 DD DD DD DD DD CD95-L CD95-R FADD/MORT1 Daune ADN p53 Figura 19: Prezentare generală a reglării căilor de semnal în apoptoză (modificată conform Hengartner 2 și Rosell 22) Pro- CASP-8 DISC BID Bcl-x L Bax Bcl-2 c-flip Bcl-2 Bcl-x L CrmA CASP-8 citocrom c Pro-CASP-9 Bcl-x L Pro-CASP -3 APAF-1 apoptozom CASP-3 IAPs Smac/DIABLO AIF moarte substraturi apoptoză
62 Răsucirea elicoidală a superhelixului ADN din nucleozom care, după ce contactele histonă-ADN au fost slăbite, dezvârte și schimbă complexul histonic (Widom 1997; Kornberg 1999). Pentru funcția unora dintre acești complecși, de exemplu pentru factorul NURF de remodelare a nucleozomilor, este necesară implicarea terminațiilor histonei acetilate. O imagine de ansamblu asupra complexelor de remodelare a cromatinei este prezentată în tabelul următor (Kornberg 1999): Promotor P mrna k 12 P nucleozom k 21 P Răsucirea ADN-ului și expunerea progresiei ADN-ului transcripției P transcript complet Figura 26: Remodelarea cromatinei prin complexe ISWI (Widom 1997) Tabelul 8: Gruparea și caracteristicile complexelor de remodelare a cromatinei Complexul de remodelare a cromatinei Organism ATPaza Greutate moleculară (MDa) Subunități SWI/SNF familie SWI/SNF S. cerevisiae SWI2/SNF2 2 11 RSC S. cerevisiae STH1 1 15 Brahma D. melanogaster Brahma 2 ND H SWI/SNF H.sapiens hbrm 2 1 H SWI/SNF H.sapiens BRG1 2 1 NRD H.sapiens CHD4 1,5 18 ISWI family I SWI1 S.cerevisiae ISWI1,4 4 I SWI2 S.cerevisiae ISWI2,3 2 NURF D.melanogaster ISWI, 5 4 CHRAC D.melanogaster ISWI, 7 5 ACF D.melanogaster ISWI, 2 4 RSF H.sapiens hiswi, 5 2