Pregătirea probelor larvare de Drosophila pentru cromatografie cu gaze-spectrometrie de masă (GC-MS) pe bază

rezumat

Acest protocol descrie modul de preparare a larvelor Drosophila pentru analiza metabolomică bazată pe GC-MS.

Abstract

Introducere

Musca fructului Drosophila melanogaster a apărut ca un sistem ideal pentru studierea mecanismului molecular care reglează metabolismul intermediar. Nu numai că majoritatea căilor metabolice sunt conservate între oameni și Drosophila, dar și senzori importanți de nutrienți și regulatori de creștere, cum ar fi insulina, Tor și Myc, sunt de asemenea activi în zbor 1, 2. Drosophila este astfel capabilă să cerceteze baza metabolică a bolilor umane, diabetului și obezității până la neurodegenerare și cancer. În acest context, dezvoltarea larvelor Drosophila oferă cadrul ideal pentru un grad metabolic cunoscut sub numele de glicoliză aerobă sau efectul Warburg. Așa cum multe tumori generează biomasă de glicoliză aerobă din carbohidrați, la fel faceți-o activând glicoliza aerobă a larvelor Drosophila pentru a promova dezvoltarea 3, 4, 5. Aceste similitudini între metabolismul larvelor și cel al tumorii stabilesc Drosophila ca model pentru înțelegerea modului în care glicoliza aerobă este reglementată in vivo.

În ciuda faptului că musca a apărut ca un model popular pentru metabolism, majoritatea studiilor privind Drosophila se bazează pe metode concepute pentru a măsura metaboliții individuali 3, cum ar fi trehaloza, trigliceridele sau ATP. Deoarece este necesar un protocol specific pentru măsurarea fiecărui metabolit, studiile bazate pe test sunt intensive în muncă, costisitoare și orientate spre acești compuși, care pot fi măsurați folosind truse comerciale. O soluție la aceste limitări a apărut din domeniul metabolomicii, care oferă un mijloc mai eficient și imparțial al metabolismului Drosophila. Spre deosebire de un studiu bazat pe test, o singură analiză metabolomică poate măsura simultan sute de metaboliți de molecule mici și poate oferi o înțelegere cuprinzătoare a stării metabolice a unui organism 6, 7. Această tehnică a extins semnificativ studiile metabolice ale Drosophila și reprezintă viitorul acestui câmp emergent 8 .

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

2. Colectarea probelor de larve

    Larvele de vârstă până la stadiul dorit. Când larvele L3 se colectează, resincronizează exemplarele la mutarea L2-L3. Resincronizarea este adesea realizată printr-o metodă descrisă anterior care folosește găurile de respirație anterioare ca o etapă importantă a tulburării de dezvoltare 15. Alternativ, larvele mijlocii L3 pot fi sincronizate cu o genă raportoare SGS3 16.
    Notă: În acest context găsim larve L2 mijlocii (

30 s. În acest timp larvele se vor scufunda până la fundul tubului, dar drojdia va rămâne în suspensie. Odată ce toate larvele au format o peletă liberă, îndepărtați soluția de NaCI cu o pipetă de 1 ml.

  • Repetați pașii de 2.4 și 2.5 de două ori sau până când ultima soluție de spălare este limpede.
    Notă: pot fi necesare etape suplimentare de spălare dacă proba colectată conține o cantitate excesivă de drojdie.
  • Centrifugați probele la 2.000 × g timp de 1 min la 4 ° C.
  • Îndepărtați orice soluție rămasă cu o pipetă de 200 µL.
  • Se congelează imediat proba în azot lichid.
    Notă: Protocolul poate fi întrerupt în acest moment. Probele pot fi păstrate până la 3 luni la -80 ° C

    • 3. Transferați probele în tuburile de margele

    16 ore pentru finalizare).
    Notă: Dacă este necesar, protocolul poate fi întrerupt în acest moment. Proba uscată poate fi depozitată la -80 ° C

    (5) derivatizarea chimică

    Notă: În majoritatea cazurilor utilizatorul va efectua acest pas cu ajutorul unei facilități de bază pentru spectroscopie de masă. Acest protocol este destinat să fie utilizat cu o coloană GC de 30 m cu o coloană de gardă de 5 m.

    1. Comandați aleatoriu proba.
    2. Pregătiți GC-MS.
      1. Setați debitul gazului purtător de heliu la 1 ml/min.
      2. Setați temperatura de curgere la 250 ° C.
      3. Programați GC pentru a rula următorul gradient de temperatură:
        1. Temperatura inițială 95 ° C cu o influență de 1 min.
        2. Ridicați temperatura la 110 ° C la o rată de 40 ° C/min pentru o reținere de 2 minute.
        3. Măriți rampa la 250 ° C până la 5 ° C/min.
        4. Măriți o oprire finală de 4 min la o rată de 25 ° C/min la 330 ° C.
      4. Setați întârzierea solventului la 3,5 minute
        Notă: Ora poate fi modificată în funcție de sistemul GC-MS. Acest pas este destinat să prevină MSTFA și MOX să deterioreze detectorul.
    3. Se injectează 1 µL din proba derivatizată în GC-MS (raport de divizare de 10: 1).
      Notă: Se injectează 2 µL din probă dacă intensitatea vârfurilor este prea mică. Ordinea de injectare a probelor trebuie randomizată.
    4. Operați spectrometrul de masă în modul de scanare completă, într-un interval de masă de 50 - 500 m/z.

    1. Analiza datelor metabolomice utilizează fie o abordare direcționată, fie nedestinată. Analiza vizată se concentrează pe măsurarea abundenței unui set definit de metaboliți, cum ar fi: B. măsurătorile lactatului, pe care le descriem mai jos. Spre deosebire de aceasta, analiza nețintită utilizează o abordare imparțială pentru a identifica orice funcție metabolică care se schimbă semnificativ între cele două seturi de probe.
      Notă: Laboratorul nostru folosește în principal programele gratuite MetAlign 17 și MetaboAnalyst 18, 19 pentru analiza datelor. Deoarece o descriere adecvată a etapelor de control al calității, normalizare și prelucrare a datelor sunt dincolo de scopul acestui manuscris, trimitem utilizatorul la protocoale mai detaliate dedicate procesării datelor 20, 21, 22. În plus, o diagramă de flux care descrie pașii pentru această analiză poate fi găsită în altă parte 8.

    Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

    Rezultate reprezentative

    Mutanții lactat dehidrogenază (dLDH) lipsiți de activitatea dLDH 4 și controalele potrivite genetic au fost colectate ca larve mid-L2 și procesate în conformitate cu protocolul descris mai sus. Comparativ cu martorii, larvele mutante prezintă modificări semnificative în lactat, piruvat și L-2-hidroxiglutarat-4. Spectrele au fost achiziționate pe un sistem Agilent GC6890-5973i MS. Un exemplu pentru generarea spectrelor GC-MS cu protocolul nostru este prezentat în Figura 1afișate. Există multe caracteristici vizibile și un vârf notabil pentru trehaloză, care este de obicei cel mai mare vârf dintr-un eșantion de larve și este de obicei suprasaturat (Figura 1AB.). Spectrul individual al probei de control negativ este prezentat în Figura 1afișate. Deși există încă câteva vârfuri vizibile în eșantionul de control negativ, intensitatea și numărul vârfurilor scad în comparație cu eșantioanele experimentale prezentate în Fig. 1A, B.. Aceste vârfuri rezultă în principal din sângerarea coloanei, standardul intern (acidul succinic-acid d4), FAME și acizii grași contaminanți. Pregătirea eșantionului eșuat generează un spectru similar cu cel din Figura 1afișate.

    Spectrele au fost preprocesate cu MetAlign 17 și datele au fost normalizate cu standardul intern și masa peletelor. Datele au fost apoi transmise către MetaboAnalyst 18, 19 pentru analize statistice. Componenta de principiu (Analiză, PCA) arată în mod clar că cele două grupuri se separă unele de altele, nu există valori aberante în niciunul dintre grupuri (Figura 2A). O analiză suplimentară arată schimbări semnificative ale metabolitului, cunoscute din pierderea de dLDH (Fig. 2b) 4 să fie afectat.

    larvare

    ilustrația 1 : Spectre reprezentative GC-MS de la Drosophila Extract de larve. (DIN) Spectre tipice ale extractelor larvelor L2 mijlocii din mutanți de tip sălbatic (WT) și dLDH (KO). (C) un spectru GC-MS reprezentativ generat de la un control negativ (NC). Majoritatea vârfurilor din această gamă sunt de la interne, vedete și grase. (D-F) Comparativ cu probele WT, probele KO au prezentat niveluri crescute de (D) Piruvat și lactat (E) și (F) 2-Hidroxiglutaratul (2-HG) a scăzut. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.

    pregătirea

    Figura 2 : Analiza statistică arată diferitele profiluri metabolice dintre tipul sălbatic (WT) și dLDH Larvele Knockout (KO). (A) PCA punctează graficul. (B) -Metaboliții care au modificat modificările în dLDH. Toate punctele de date sunt trase în raport cu valoarea medie a elementului de control WT, care a fost setată la orice valoare de 100. Înainte de analiză, datele normalizate privind acidul succinic intern d4 erau standard și masa peletelor larvare. Date ca medie ± o abatere standard. p Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

    Discuţie

    Metabolomica oferă o oportunitate unică de a măsura reacțiile metabolice pentru a compune metabolismul intermediar. Sensibilitatea acestei tehnologii face totuși datele vulnerabile la fundalul genetic, la indicii de dezvoltare și la o varietate de presiuni de mediu, inclusiv temperatura, umiditatea, densitatea populației și disponibilitatea nutrienților. Prin urmare, o analiză metabolomică de înaltă calitate și reproductibilă necesită recoltarea probelor în condiții foarte controlate. În timp ce unele postări despre acest punct subliniază 3, 8, 23, aici oferim o metodă de colectare a larvelor pas cu pas concepută pentru a asigura reproductibilitatea.

    Cea mai frecventă cauză a variabilității în analiza metabolomică apare dintr-un eșec la alăptarea sau oprirea reacțiilor metabolice după capturarea probei. În acest sens, metabolismul se oprește când este înghețat în azot lichid și enzimele metabolice sunt distruse atunci când proba este omogenizată la -20 ° C metanol. Presupunând că utilizatorul acordă o atenție specială păstrării unei eșantioane înghețate înainte de extracția metanolului, protocolul nostru este destinat să se asigure că datele metabolomice generate de această procedură reprezintă un instantaneu exact al metabolismului larvelor. În cazul în care utilizatorul are o variabilitate inacceptabilă a datelor, utilizatorul ar trebui să reconsidere protocolul de colectare și extracție a metabolitului, acordând o atenție deosebită asigurării (1) metabolismului rapid stins (pașii 2.9-4.2) și (2) proba devine eficientă omogenizat în 90% metanol (etapa 4.4). În acest sens, multe fabrici de mărgele nu furnizează suficientă putere pentru omogenizarea probelor în timpul specificat și recomandăm utilizatorului să utilizeze un instrument care a fost utilizat în studiile anterioare 8.

    În cele din urmă, metodele prezentate aici sunt un instrument puternic pentru metabolismul Drosophila. Totuși, acest protocol nu este specific Drosophila și poate fi utilizat pentru studii metabolice de conducere la orice nevertebrat mic, cu puține modificări. Indiferent de specie, această metodă simplă poate fi utilizată pentru cuantificarea relativă a aproape tuturor aminoacizilor, intermediari în glicoliză și ciclul TCA, precum și o serie de alte molecule polare mici. Împreună cu instrumentele genetice incomparabile disponibile comunității Drosophila, acest tip de analiză metabolomică plasează musca în prim-planul cercetării metabolice pentru viitorul previzibil.

    Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.