Studii privind eficacitatea antioxidantă a ingredientelor polifenolice din suc de mere în
Studii privind eficiența antioxidantă a constituenților polifenolici ai sucului de mere în celulele colonului uman Disertație aprobată de departamentul de chimie al Universității Tehnice din Kaiserslautern pentru acordarea diplomei universitare Doctor în Științe ale Naturii (D386) prezentată de chimistul alimentar absolvent Sandra Schäfer Kaiserslautern, 2006
Prezenta lucrare a fost creată între iunie 2002 și noiembrie 2005 în departamentul de chimie, chimia alimentelor și toxicologia mediului de la Universitatea Tehnică din Kaiserslautern. Ziua discuției științifice: 25 aprilie 2006 Președintele Comitetului de examinare: Prof. Dr. H. Sitzmann Reporter 1: Prof. Dr. G. Eisenbrand Raportor 2: Prof. Dr. Dr. D. Schrenk Îi mulțumesc prof. Dr. G. Eisenbrand și Dr. C. Janzowski pentru furnizarea subiectului, precum și pentru sugestii și sprijin binevoitor în timpul perioadei de doctorat.
Cuprins 5.5.2.1 Adăugarea acidului ascorbic. 152 5.5.7.1 Dependența și reversibilitatea pH-ului. 154 5.5.8 REZUMATUL STABILITĂȚII PLIFENILOR 157 6 DISCUȚIE ȘI PERSPECTIVE. 158 7 REZUMAT. 168 8 LISTA LITERATURII. 170 9 ANEXĂ. I 9.1. ILUSTRAȚIILE NU SE AFIȘĂ. I 9.2 CV. V 9.3 TRIMITERI ȘI PUBLICAȚII PSTER. VI
Lista abrevierilor ph pk a PKA PKC PKZ Plt Plz Que, QQ - Qq ra (p) e RS RP RT Rut SD SE SGLT1 SD SRB SSA SSB SULT TAC TBARS TEAC TCA TEA tgsh TI% TNB TRAP Tris UDPGT UDP VdF Logaritmul concentrației ionilor de hidrogen Logaritm Protein kinază constantă de disociere a acidului A protein kinază C celule de colon primare (umane) floretină floridzină quercetină quercetină-o-semiquinonă quercetinchinone amestecuri reconstituite de suc de mere (tescovină) specii de oxigen reactiv extrakte, engl. pentru speciile de oxigen reactiv timpul de retenție a fazei inversate rutina deviație standard pentru eroare standard de deviere standard pentru eroare standard transportor de glucoză dependent de sodiu superoxid dismutază sulforhosamină acid sulfosalicilic rupere cu un singur fir, engl. pentru rupere cu un singur fir fenol sulfat transferază capacitate antioxidantă totală acid tiobarbituric substanțe reactive Trolox echivalent capacitate antioxidantă acid tricloracetic trietanolamină glutation total Intensitate coadă, engl. pentru intensitatea cozii 5-tio-2-nitrobenzoat peroxil total de captare a potențialului radical tris (hidroximetil) aminoetan UDP glucuronil transferază uracil difosfat Asociația industriei germane a sucurilor de fructe e.v.
Fundamentele teoretice pot fi prevenite printr-o dietă și un stil de viață adecvate [Donaldson, 2004]. Mecanisme moleculare ale carcinogenezei colonului Carcinogeneza este un proces în mai multe etape care include modificări moleculare și celulare. Procesul poate fi împărțit în trei etape legate: inițierea tumorii, promovarea, progresia (Figura 3.3). I N I T I A T I N P R M T I N mutație celulară normală a genelor care reglează creșterea: APC, K-ras etc. selecția celulelor inițiate creșterea celulelor inițiate mutația aberantă a focarelor criptelor, ștergerea DCC, p53 determină FAP endogen, genotox HNPCC. Subst. Viruși RS Mediatori de inflamație Deteriorarea țesuturilor, CU, MC Adenom P R G R E S S I N Selecție Carcinom Invazie Metastaze Figura 3.3: Proces în mai multe etape de dezvoltare a cancerului de colon, modificat din [Schulte-Hermann și colab., 2004]; Abrevieri: APC: polipoză adenomatoasă coli; FAP: sindrom de polipoză adenomatoasă familială; HNPCC: sindrom de cancer colorectal nepolic; CU: colită ulcerativă; MC: Boala Crohn; DCC: eliminat în cancerul de colon 9
Principii teoretice Cu un consum ridicat de proteine, există un transfer crescut de proteine, peptide și uree în colon. Printre altele, metabolismul bacterian produce cationul de amoniu (NH + 4). Acest lucru este citotoxic în experimentele pe animale și poate juca un rol în carcinogeneză. [Biesalski, 1999] 12
Baza teoretică NADP + NADPH FAD roșu FAD ox peroxidare lipidică chinonă semiquinonă radicală redox ciclare inactivare enzimă H Reacție Haber-Weiss 2 deteriorare ADN Fe reacție Fenton Fe 2 - H 2 2 SD 2 2 CAT GSH NADP + GPx GSR H 2 GSSG NADPH Figura 3.4: Exemple de dezvoltare a diferitelor RS, mecanisme de apărare și daune (verde: detoxifiere, roșu: consecințe directe ale reacțiilor RS; modificat din [Kelly și colab., 1998, Sies, 1985]; CAT: catalază, GSH: glutation redus, GSSG: glutation oxidat, GPx: glutation peroxidază, GSR: glutation reductază, SD: superoxid dismutază, CYP: citocrom monohidrogenazele dependente de P450 Radicalul hidroxil H acționează ca cea mai reactivă specie de oxigen [Sies, 1991] cu un potențial standard de reducere de 2,31 V puternic oxidant [ Halliwell și Gutteridge, 1999]. H poate apărea în multe sisteme relevante din punct de vedere biologic, de exemplu, prin reacția Haber-Weiss catalizată de ioni grasi (de exemplu cu cupru sau fier, - Ec. 3.7) din 2 și H2 2. Reacția parțială catalizată de ionul de fier este, de asemenea, cunoscută sub numele de reacția Fenton (ec. 3.6) [Eisenbrand și Metzler, 2005]. 2 - + Fe 3+ 2 + Fe 2+ (3,5) Fe 2+ + H 2 2 H + H - + Fe 3+ (3,6) 2 - + H2 2 H + H - + 2 (3,7) 14
Fundamente teoretice 3.3. Stresul oxidativ și consecințele sale 3.3.1 Peroxidarea lipidelor (LP) Rolul important al lipidelor în componentele celulare subliniază importanța deteriorării lor posibile prin oxidare în sistemele biologice. Această reacție de oxidare, cunoscută și sub numele de reacție în lanț LP, este împărțită în trei faze: inițiere, propagare, terminare și este prezentată schematic în Figura 3.5. LH R RH Inițiere LH L 2 LH Extensie lanț L X Produs stabil de terminare Figura 3.5: Prezentare generală a LP, conform [Kelly și colab., 1998]; LH: acid gras; R: specii reactive; X: molecula cu care L reacționează. Reacția în lanț este declanșată de specii reactive care pot extrage un atom de hidrogen dintr-o grupare metilenică (inițiere). H începe reacții în lanț cu toți acizii grași, în timp ce 2 reacționează numai cu unii acizi grași activi în special [Halliwell și Gutteridge, 1999]. Acest lucru creează radicali alchil și peroxil, care reacționează apoi cu alți acizi grași. Reacția în lanț radicală se ramifică prin descompunerea peroxizilor, din care apar doi radicali (propagare). O rupere a lanțului are loc prin reacția radicalilor cu molecule care formează produse stabile (terminare). [Belitz și colab., 2001; Kelly și colab., 1998] 17
Bazele teoretice Substraturile ideale pentru LP sunt acizii grași polinesaturați cu grupări de metilen bisalic. În aceste poziții, legăturile carbon-hidrogen au energii de disociere scăzute, astfel încât extracția hidrogenului prin reacții radicale este ușor posibilă. [Kelly și colab., 1998] Peroxidarea lipidelor și fragmentarea asociată cu aceasta duc la o mare varietate de molecule saturate și nesaturate, de ex. Alcani, aldehide, cetone și furani [Belitz și colab., 2001]. Pe lângă proprietățile ca componente aromatice, aceste molecule reactive pot avea și efecte citotoxice, genotoxice și mutagene [Marnett, 1999]. Formarea malondialdehidei (MDA) ar trebui explicată ca un exemplu de produs LP: R2, 2 RH CCH 3 extensie lanț CCH 3 ciclizare CCH 3 2, RH R CCH 3 H căldură, H + CCH 3 fragmentare malondialdehidă + H CCH 3 Figura 3.6: Formarea malondialdehidei (MDA) din acidul α-linolenic, conform [Belitz și colab., 2001] MDA se formează din acizi grași polinesaturați prin reacție cu un radical peroxil, oxigen, ciclizare ulterioară și fragmentare (Figura 18
Principii teoretice NH 2 NH 2 HN NHNNNNNH 2 NNHHNNHNNH 8-hidroxiguanină 2-hidroxadenină 8-xiadenină HN NH CH 3 HHH HN NHHHNH 2 HN HNN NH 2 CH timin glicol 5- (hidroximetil) uracil 2,6-diamino-4-hidroxi 5-formamidopiridină Figura 3.7: Exemple de pirimidine și purine oxidate, conform [Meneghini, 1997]. Un atac de către D poate duce la o varietate de produse, de ex. Oxidarea guaninei în poziția 4, 5 sau 8 (8-xo-deoxiguanină sau 8-hidroxidoxiguanină, 8-H-dG) a inelului purinic, ceea ce duce la produse deschise în inel, cum ar fi 2,6-diamino-4-hidroxi-5-formamidopirimidină ( FaPy) continuă să reacționeze (Figura 3.8). Un atac asupra pirimidinelor poate duce, de asemenea, la dimeri de bază. [Halliwell și Gutteridge, 1999, Jaruga și Dizdaroglu, 1996, Kelly și colab., 1998] HN NH 2 NNNR xoxare deoxiguanină H reducere NH 2 HN NNNR deschidere inel NH 2 HN NNNRHH 8 HG NH 2 HN NCNNRHH + e -, + H + + e -, + H + + e -, + H + NH 2 HN NN NH R Deschiderea inelului NH 2 HN NNNRHHNH 2 HN NNNRH FaPy 8-H-dG Figura 3.8: Modificări ale deoxiguaninei de către radicalii H, conform [Halliwell și Gutteridge, 1999] 20
Bazele teoretice Repararea ADN Sistemele de reparare a ADN recunosc bazele de ADN modificate și nepotrivite. Astfel de modificări sunt în principal baze oxidate [Christmann și colab., 2003]. Prin recunoașterea și tăierea bazei deteriorate de către ADN glicozilaza, se creează așa-numitele site-uri de apurină/apirimidină (AP) și se pune în mișcare cascada de reparații a reparării exciziei de bază (BER), cel mai important sistem de reparare pentru deteriorarea ADN oxidativ Figura 3.11). AD glicozilază AP liază ADN glicozilază AP liază APE1 APE1 Pol δ/ε Polβ Polβ Fen-1/PCNA Polβ Lig1 Lig3 Figura 3.11: reprezentare schematică a BER, conform [Scharer, 2003]; verde: parcurs scurt - cale, parcurs lung violet; Abrevieri în text. AP endonuclează-1 (APE1) hidrolizează legătura fosfat pe partea 5 a siturilor abasice. Polimeraza β (Polβ) introduce o nucleotidă în secvență în situsul abasic și apoi îndepărtează situsul abasic datorită activității sale de AP liasă. ADN ligaza III (Lig3) închide porecla și restabilește astfel secvența ADN originală. Dacă BER este cauzat de ADN glicozilazele bifuncționale/APLiazele 25
Poziția teoretică [Manach și colab., 2004]. În plus, sunt posibile și ramuri și legături cu non-flavonoide. Proantocianidinele contribuie la gustul amar și astringent din alimentele vegetale [Jorgensen și colab., 2004]. La merele de cidru, gradul de polimerizare este în principal între patru și unsprezece unități de flavanol [Manach și colab., 2004]. 3.4.1.2 Derivați de floretină Floretina și glicozidele sale (în principal floretină-2-glucozidă = floridzină și floretină-2-xiloglucozidă) aparțin dihidrocalconelor, structura lor este prezentată în Figura 3.13. H H H R R = H: floretină R = glucoză: floridzină Figura 3.13: Structura floretinei și floridzinei Acestea apar în mod natural aproape exclusiv la mere, precum și la frunzele și scoarța mărului. Un alt punct de origine pentru floretin este defalcarea microbiană a apigeninei în intestinul gros (capitolul 3.4.4). 3.4.1.3 Derivați ai acidului hidroxicinamic Unul dintre cei mai comuni acizi hidroxicinamici este acidul cafeic, care se găsește de obicei în natură esterificat cu acid chinic sau cu glucoză. Acidul 5-cafeoilchinic este, de asemenea, cunoscut sub denumirea de acid clorogenic (Figura 3.14). 30
Bazele teoretice HHRR = H: acid cafeic R = acid quinic (C5): acid clorogenic HH 4 5 2 3 1 6 HH acid chinic CH Figura 3.14: Structurile acidului cafeic și acidului clorogenic conform [Belitz și colab., 2001] Acidul clorogenic se găsește în principal în cafea și mere., dar și în alte fructe de piatră și pietre [Belitz și colab., 2001; Iwai și colab., 2004]. În cafeaua tare, pot fi atinse niveluri de până la 500-800 mg/l [lthof și colab., 2003]. Consumatorii care nu consumă cafea ingeră până la 100 mg de acid clorogenic pe zi, în timp ce consumatorii de cafea consumă 500-1.000 mg/zi [lthof și colab., 2001]. 3.4.2 Absorbție Deoarece compușilor fenolici li se atribuie efecte bioactive in vivo, absorbția în intestinul subțire este o condiție prealabilă. Figura 3.15 ilustrează căile posibile ale polifenolilor din alimente în tractul gastro-intestinal. Polifenoli Polfenoli Țesut Intestin subțire Ficat Colon Colon Bilă Rinichi Fecale Urină Figura 3.15: Căi posibile de polifenoli la om, conform [Scalbert și Williamson, 2000] Mărimea și mecanismul de absorbție sunt controversate (Tabelul 3.3). 31
Baza teoretică Tabelul 3.3: Selecția studiilor in vivo și in vitro privind absorbția derivaților de quercetină Studiu Substanță Absorbție Metaboliți Literatură pacienți cu ileostomie Quercetin 1 glicozide Ceapă Rutină 24% 52% 17% [Hollman și colab., 1995] Subiecți testați (plasmă peste 24 de ore) Glicozide ceapă rutină glicozide măr