Analiza optimizată a protocolului de steatoză hepatică in vivo și in vitro (tradus în germană)
Introducere
Obezitatea este o problemă de sănătate în creștere atât în țările dezvoltate, cât și în țările în curs de dezvoltare. Una dintre condițiile coexistente 1 a fost raportată ca fiind frecvent asociată cu ficatul gras nealcoolic (NASH), cu o prevalență cuprinsă între 30 și 100% la pacienții cu NASH. Datorită corelației puternice dintre ficatul gras și obezitate, modelele de șoarece obez induse de dietă (DIO) sunt utilizate pe scară largă pentru a studia mecanismele moleculare complexe implicate în dezvoltarea NAFLD 2, 3, 4, 5, 6. Steatoza hepatică este cea mai timpurie etapă a NAFLD și poate evolua către steatohepatită nealcoolică (NASH), ciroză și, în cele din urmă, cancer hepatic 7. Prin urmare, scopul general al acestei metode este de a genera modele animale și celulare ale condițiilor steatotice hepatice și de a furniza protocoale detaliate pentru o utilizare eficientă. și măsurarea precisă a lipidelor. Aceste modele și măsurători sunt, de asemenea, potrivite pentru studierea altor tulburări metabolice, cum ar fi rezistența la insulină și diabetul de tip 2.
Deoarece obezitatea este identificată ca unul dintre factorii de risc majori pentru NAFLD, o dietă bogată în grăsimi, bogată în zaharoză (HFHS) care imită dieta bogată în grăsimi în stil occidental este utilizată pentru a induce obezitatea la șoareci. Gradul de steatoză hepatică poate fi apoi evaluat folosind diferite metode. În primul rând, analiza greutății corporale și a compoziției corporale utilizând rezonanța magnetică nucleară (RMN) arată acumularea de lipide în timpul hrănirii. Masa grasă și masa musculară pot fi cuantificate într-un mod neinvaziv și în timp real.
În plus, imagistica prin rezonanță magnetică (RMN) este utilizată pentru a arăta atât distribuția grăsimii în întregul corp, cât și a ficatului. Semnalul în tonuri de gri din analiza RMN poate fi convertit într-o imagine pseudo-culoare lizibilă, iar intensitatea tonului de gri și a culorii este semicuantificabilă. Această tehnologie oferă avantaje unice pentru măsurarea acumulării de lipide la animalele vii. În al doilea rând, analiza histologică a ficatului este cea mai comună metodă utilizată pentru determinarea steatozei hepatice. Colorarea cu hematoxilină și eozină (H&E) oferă date histologice, cum ar fi morfologia hepatocitelor și infiltrarea macrofagelor, în timp ce colorarea cu ulei roșu-O arată dimensiunea și poziția picăturilor de lipide din hepatocite. În al treilea rând, analiza conținutului de lipide utilizând extracția cloroformului/metanolului este o măsurare precisă și cantitativă a lipidelor hepatice. Nivelul total al trigliceridelor și al colesterolului poate fi măsurat folosind metode biochimice. Este important ca analiza extracției lipidelor și colorarea cu roșu uleios să fie utilizate și în hepatocitele manipulate genetic sau tratate farmaceutic.
Avantajul prezentei metode este utilizarea mai multor abordări optimizate pentru a genera modele steatotice hepatice și pentru a caracteriza în mod cuprinzător fenotipurile atât in vivo, cât și in vitro. Modelele de șoarece DIO pot recapitula patologia și fenotipul metabolic al bolii hepatice grase umane. Alți parametri metabolici la om pot fi reproduși și în acest model 8. Generarea modelului de hepatocite steatotice ca răspuns la glucoză ridicată plus insulină este eficientă, utilă și depășește limitarea funcționării costisitoare și consumatoare de timp a șoarecilor. Luate împreună, aceste metode sunt suficiente și necesare pentru investigarea tulburărilor lipidice hepatice și a rezistenței la insulină în cazul suprasolicitării nutrienților.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Protocol
Toate protocoalele de testare pe animale au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Institutul de nutriție umană, Institutul de Științe Biologice din Shanghai, Academia de Științe din China (Shanghai, China).
2. Modelul primar de hepatocite de șoarece
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Rezultate reprezentative
Ca în 1A După cum se arată, greutatea corporală a șoarecelui a fost mărită la 45 ± 1,2 g după 16 săptămâni de hrănire cu HFHS, care este de aproximativ 1,5 ori mai mare decât grupul de aprovizionare cu dieta Chow. Analizele compoziției corpului RMN care arată masa grasă și masa musculară a șoarecilor sunt date (1B). Distribuția de grăsime a întregului corp și a ficatului a fost determinată prin RMN, iar imaginile pseudo-color reprezentative la șoarecii conștienți vii sunt în 1C-D afișate. Greutatea corporală și compoziția corporală au fost măsurate și vizualizate în timpul procesului de hrănire a dietei HFHS.
Pentru a diseca fenotipurile steatotice, șoarecii au fost sacrificați și s-a efectuat analiza histologică hepatică. Petele H&E și Oil Red O ale ficatului sunt prezente 2A-B demonstrat în picăturile de lipide mai mari și ocupă interstițiile în majoritatea hepatocitelor după 4 luni de hrănire cu dieta HFHS. Gradul de steatoză hepatică a șoarecilor HFHS hrăniți cu dietă este ușor vizualizat prin compararea șoarecilor hrăniți cu dieta Chow. Principalele componente ale lipidelor, cum ar fi trigliceridele și colesterolul, au fost extrase folosind cloroform/metanol (2C) măsurat. La șoarecii DIO, excesul de supraîncărcare a nutrienților provoacă acumularea anormală de trigliceride în ficat. Cu date din RMN, RMN și analize histologice, gradul de depunere a lipidelor va fi determinat în mod eficient și precis.
Ca în 3 afișat, nivelurile de lipide din hepatocitele primare au fost induse de glucoză ridicată plus insulină timp de 24 de ore. Picăturile de lipide acumulate au fost indicate prin colorarea cu roșu ulei O (3A) iar analiza cantitativă a lipidelor a fost urmată de nivelurile de trigliceride și colesterol din hepatocite (3B) este folosit pentru a măsura determinat. Pe baza modelului, efectele modificării genetice sau ale tratamentului farmaceutic asupra homeostaziei lipidice în hepatocite pot fi studiate într-un mod eficient și rapid.
Discuţie
NASH este o serie de boli hepatice progresive asociate cu sindromul metabolic, obezitatea, rezistența la insulină sau diabetul zaharat de tip 2 (T2DM) 11. Semnul distinctiv al NAFLD este steatoza, acumularea de lipide în hepatocite. Aici este prezentat un spectru de metode pentru a caracteriza fenotipurile și parametrii steatozei hepatice folosind șoareci DIO și hepatocite primare de șoarece. Această procedură ar putea ajuta la elucidarea mecanismelor moleculare ale NAFLD și a altor tulburări metabolice conexe.
Analizele compoziției corpului, inclusiv RMN și RMN, oferă date neinvazive și în timp real despre lipide în întregul corp și în ficat. Este o măsurare neinvazivă, economisitoare de timp, vizualizabilă și semi-calitativă. În plus, acuratețea analizelor compoziției corpului poate fi mult îmbunătățită prin combinarea altor măsurători histologice și biochimice. Este esențial și necesar să se determine steatoza hepatică in vivo și in vitro folosind colorarea H&E, colorarea Oil Red-O și măsurarea lipidelor, toate acestea fiind măsurători standard de aur pentru diagnostic și gradarea steatozei hepatice.
Una dintre limitările prezentei metode este incapacitatea sa de a măsura inflamația și depunerea de colagen pe măsură ce steatoza simplă progresează către hepatită, fibroză și, în cele din urmă, ciroza și cancerul hepatic. Deoarece șoarecii obezi induși de dietă au un risc scăzut de a dezvolta NASH, protocolul actual este suficient pentru a evalua steatoza hepatică la șoarecii DIO. Cu toate acestea, în condițiile NASH, ar trebui utilizate alte măsurători biochimice, cum ar fi nivelurile plasmatice de alanină aminotransferază (ALT) și aspartat aminotransferază (AST).
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Dezvăluiri
Autorii afirmă că nu au interese financiare.
Finanțare: Această lucrare a fost susținută de subvenții de la Fundația Națională pentru Științe Naturale din China (nr. 81270930, 31471129 și 31671224) și programul Sute de talente al Academiei de Științe din China (2013OHTP04) către YL