Generarea de șoareci himerici cu mutații în domeniul semnalizării CD22 și
Generarea șoarecilor himerici cu mutații în domeniul semnalizării CD22 și studii privind funcția CD22 la șoarecii knockout Disertație pentru obținerea doctoratului științific de la Universitatea bavareză Julius Maximilians din Würzburg prezentată de Claus-Peter Danzer de la Mannheim-Neckarau Würzburg, 2002
Trimis la: Membrii comitetului de doctorat: Președinte: Recenzor: Dr. rer. nat. habil. Lars Nitschke Recenzent: Prof. Dr. rer. nat. Gert Pflugfelder Ziua colocviului de doctorat: Certificat de doctor înmânat la:
Explicație: Prin prezenta declar că am efectuat disertația privind generarea șoarecilor himerici cu mutații în domeniul de semnalizare al CD22 și investigații privind funcția CD22 la șoarecii knock-out și că nu am folosit alte mijloace sau surse decât cele specificate de mine. De asemenea, declar că această disertație nu a fost prezentată în nicio altă procedură de examinare, nici în aceeași formă, nici într-o altă formă. În afară de diplomele documentate cu cererea de admitere, nu am mai obținut sau am încercat să dobândesc alte studii academice. Würzburg, Claus-Peter Danzer
Prezenta lucrare a fost realizată în perioada 15 ianuarie 1998 - 31 ianuarie 2002 la Institutul de Virologie și Imunobiologie al Universității Bavareze Julius Maximilians din Würzburg sub supravegherea Dr. rer. nat. habil. Lars Nitschke a făcut.
IV 7.2 Lista publicațiilor. 111 7.2.1 Teze originale din această teză de doctorat. 111 7.2.2 Publicații la congrese/conferințe. 111 8. Anexă. 113 8.1 Abrevieri. 113 8.2 Secvențe primare. 115 8.3 Hărți vectoriale. 117 9. CV. 120
13 compartiment. Prin urmare, au existat motive pentru a suspecta că numărul de celule MZ B la șoarecii CD22 -/- ar putea fi redus. Prin urmare, ar trebui investigate dimensiunea compartimentului pentru celule B MZ la șoareci CD22 -/- și consecințele unei posibile reduceri a răspunsului la antigenii TI-2.: acid α2,6-sialic CD22-ITIM- KO CD22-Syill SOS fără coadă? Grb-2 P Y- P Y- P Y- -F ITIM SHC Grb-2 SHIP Lyn PI3K PLCγ2 -F ITIM -F ITIM SH2 SH2 PTPase SHP-1 Fig. 3: Două modele de mouse planificate pentru a studia transducția semnalului CD22 in vivo . Partea stângă: CD22-ITIM-KO: Tirozinele din ITIM au mutat în fenilalanine. Este de așteptat ca proteina tirozin fosfatază SHP-1 care inhibă semnalul să nu mai poată interacționa cu CD22 și să poată fi astfel activată. În contrast, legarea modulatorilor de semnal pozitivi ai celulelor B PLCγ, Lyn, PI3K și Grb-2 va fi încă posibilă. De asemenea, este posibil să legați SHIP ca parte a unui complex SHIP-Grb2-Shc. Partea dreaptă: CD22-fără coadă: un codon de oprire în exonul 12 duce la exprimarea unei molecule CD22 fără domeniu citoplasmatic. Acest model de mouse va completa CD22-ITIM-KO. Ambele modele vor servi, de asemenea, pentru a elucida relația dintre transducția semnalului și funcția de adeziune a CD22.
14 2.1 Materiale 2. Materiale și metode 2.1.1 E.coliNM522 tulpini bacteriene: (F`lacIq (lacz) m15 proa + prob + (hsdms-mrcb) 5 (lac-proab) supe thi-1 lambda) a servit inițial ca tulpină de clonare E. .coliDH5α: F- delta (laczya-argf) u169 phi80delta (lacz) m15 enda1 reca1 hsdr17 deor thi-1 supe44 gyra96 rela1 rpsl lambda- a fost utilizată ca tulpină de clonare standard în cursul ulterior al acestei teze de doctorat E. coliBNN132: enda1. delta (lac-proab) (F trad36 proa + prob + laciq delta (lacz) m15) lambdakc (kan-cre) a fost folosit pentru a testa funcționalitatea secvențelor loxp în construcțiile de țintire utilizate. E. coliJM110: F [trad36 proa + prob + laciq delta (lacz) m15] dam dcm supe44 hsdr17 thi leu thr rpsl lacy galk ara tona tsx delta (lac-proab) lambda a servit drept tulpină gazdă pentru plasmide care au tăiat cu endonucleaze de restricție sensibile la metilare ar trebui să fie. 2.1.2 Substanțe chimice Cu excepția cazului în care se specifică altfel, substanțele chimice de laborator provin din Roth (Karlsruhe) sau Merck (Darmstadt) 2.1.3 Tampoane și soluții utilizate în mod repetat Tampon TE 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, pH 8,0 PBS (tamponat cu fosfat) Salină) 8 g NaCI, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4, 0,24 g KH 2 PO 4, 0,133 g CaCl 2 2H 2 O, 0,1 g MgCl 2 6H 2 O cu HCl ph7.2 tampon FACS 1 x PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN 3
36 loxp loxp pcd22-itim-ko tk neo 1112 13 14 15 care vizează genomul. Locus loxp loxp tk neo recombined Locus Cre deletion loxp rec./ cre-delet. Exonul locus 11-15 ITIM-uri mutate (Y F) 1 kb Fig. 6: Cursul recombinării omoloage a vectorului pcd22-itim-ko cu locusul CD22 endogen. Ștergerea ulterioară a casetei de selecție cu Cre recombinază lasă doar ITIM-urile mutate în exonii 13 și 15 și o secvență loxp în intronul 14/15 ca modificări.
43 neo probe pcd22-3bs-hindiii probe EBEBE 1112 13 14 15 9,5 kb WT EcoRI fragment gen. Locus EB 11 kb WT BamHI fragment B targeting EBE tk neo B loxp loxp EB recombined locus EE 9,5 kb recombined 3 kb recombinat EB 9 kb recombinat B 6 kb recombinat B mutația exonului 11-15 (codon stop) Fig. 11: locus CD22 locus și locus recombinat cu pcd22-ex12-stop cu site-uri de clivaj pentru enzimele de restricție BamHI (B) și EcoRI (E. ). Fragmentele prezentate rezultă după digestie cu EcoRI sau BamHI. Modificări ale fragmentelor de restricție de tip sălbatic (WT) apar în timpul recombinării prin interfețe EcoRI în neo-casetă sau prin interfața BamHI din primerii de mutageneză.
44 a) 11kb greutate/greutate greutate/fără coadă M12.2.3 M12.4.1 b) 9,5kb greutate/greutate/greutate M12.2.3 M12.4.1 9,5kb 9kb 6kb 3kb digestie: sondă BamHI: digestie pcd22-3bs-hiii: Sonda EcoRI: pcd22-3bs-hiii c) greutate/greutate fără greutate/greutate M12.2.3 M12.4.1 digestie de 9kb: sondă BamHI: neo Fig. 12: Pete sudice ale clonelor celulare CD22 ES fără coadă recombinate .2.3 și M12.4.1, fiecare prezentată cu o clonă de control de tip sălbatic (greutate/greutate). Reprezentarea schematică a locusului de tip sălbatic și a locusului recombinat, a fragmentelor care rezultă din digestia cu EcoRI sau bamhi și a sondelor, vezi p. Figura 11. a) CD22-ITIM-KO ADN-ul genomic al clonelor CD22-ITIM-KO identificate ca pozitive a fost digerat cu BamHI. Digestia BamHI a locusului de tip sălbatic are ca rezultat un fragment de restricție de 11 kb. Integrarea constructului pcd22-itim-ko în locusul de tip sălbatic crește acest lucru
45 fragment pe 14 kb. Pcd22-3bs HindIII și sonda din interiorul neo-casetei au fost din nou folosite ca sondă. Figura 13. pcd22-3bs-hindiii-sonde neo-sonde BBB 1112 13 14 15 11 kb WT BamHI fragment B gen. Locus targeting of recombined locus B loxp tk oferă o imagine de ansamblu asupra fragmentelor formate în digestia BamHI și a sondei utilizate neo loxp BB 14 kb recomb. Fragmentul BamHI B exonul 11-15 ITIM mutate (Y F) 1 kb Fig. 13: Locus CD22 și locus de tip sălbatic recombinat cu pcd22-itim-ko cu situri de clivaj pentru enzima de restricție BamHI (B). Fragmentele prezentate apar după digestia cu BamHI. Prin integrarea casetei neo/tk, locusul recombinat este mărit cu 3 kb comparativ cu locusul de tip sălbatic. Ca exemplu, FIG. 14 prezintă un blot sudic al clonelor CD22-ITIM-KO YFtar3F1 și YFtar10E3. Părțile au arătat că YFtar3F1 și YFtar4E6 nu conțin integrări suplimentare. Cu toate acestea, pentru YFtar10E3, o altă copie a constructului a fost găsită în genom (nu este prezentată).
57 pcd22-itim-ko loxp loxp 1 kb tk neo 1112 13 14 15 1) Găsirea secvenței genomice 2) Dezvoltarea unei strategii de clonare 3) Clonarea PCR 4) Secvențierea 5) Ștergerea HSV-tk loxp loxp neo 8 9 10 1112 13 14 15 129/ola pcd22-itim-ko-ext-tk exon 8-15 ITIM mutate (YF) Fig. 17: Pentru a crește frecvența recombinării omoloage a vectorului C57BL/6 pcd22-ITIM-KO în non-izogenice Liniile celulare 129-ES, vectorul a fost extins cu o bucată de ADN E14Tg2a amplificată prin PCR. O condiție prealabilă a fost găsirea unei secvențe aproape complete de mouse CD22 într-o căutare în baza de date. A fost efectuat un experiment de direcționare în linia celulară ES WW6, cu etapa intermediară a celor doi vectori pcd22-itim-ko-ext (neprezentată) prezentată în imagine (a se vedea textul).
58 Construct Tailless (03/99) ITIM-KO (11/99) Tailless (05/00) ITIM-KO (05/00) ITIM KO (06/00) Linia de celule ES Numărul de clone ecranate PCR pozitiv PCR reproducere. C57BL/6-III 300 8-4 C57BL/6-III 500 5 3 3 C57BL/6-III 200 3 2 2 C57BL/6-III 150 2 2 2 Southern Blot C57BL/6-III 400 0 - - - condiții de cultură modificate: Mediu nou, PBS, Pen/Strep, Gln, cadran β-me ITIM-KO (08/00) conform PCR-Optim. Cadran fără coadă (08/00) conform PCR-Optim. ITIM-KO (11/00) fără coadă (11/00) ITIM-KO (02/01) fără coadă (07/01) BALB/cI 600 0 - - - 150 1 0 - - BALB/cI 600 1 0 - - 600 7 0 - - C57BL/6-III 500 6 2 - C57BL/6-III 400 12 11 - E14Tg2a 500 2 0 - - E14Tg2a 650 2 0 - - Des. M12 2.1, 2.3, 4.1, 4.2 YFtar3F1, 4E6, 10E3 M12 8D1, 10D5 YFtar12B5, 12A4 YFtar29D2, 30F1 M12 15F5, 17B3,17B7, 17C7,18A3, 18B5,19A1, 19F2,21C4, 21E5d221E -itim-ko pcd22-itim-ko-ext-tk, utilizați ESGRO ITIM-KO (10/01) WW6 400 0 - - - ITIM-KO E14Tg2a 960 0 - - - Tab. 1: Prezentare generală a tuturor experimentelor de direcționare genetică a acestei teze de doctorat și a clonelor recombinate omolog obținute
59 luni/an injector pasaj clonă tânăr împerechere 05/00 M12 2,3 M12 4,1 aproximativ 30 P aproximativ 06 30 PF 06300 YFtar3F1 aproximativ P 21 09/00 M12 10D5 aproximativ P 17 09/00 YFtar12B5 aproximativ P 17 YFtar3F1Cre C/B2 aprox P 32 B. Ledermann B. Ledermann B. Ledermann B. Ledermann none - none - none - 2 himera B. Kneitz none - cu BL/6, fără transmisie germinală 12/00 12/00 01/01 03/01 03/01 04/01 05/01 07/01 08/01 YFtar3F1Cre C/B4 YFtar3F1Cre C/B2 YFtar3F1Cre C/B4 YFtar3F1Cre C/B2, C/B4 YFtar3F1Cre B1 YFtar12B5 Cre S2F4, S2C5 YFtar S1C8 YFtar12B5 Cre S1F7, S2F7 YFtar12B5 Cre S1A1, S3A7, S3D8 YFtar12B5 CreS3B8 aprox P 32 B. Kneitz 8 băieți, 4 dintre ei himerici aprox P 32 B. none - aprox P 32 Ledermann none - aprox P 34 B. Kneitz 2 morți, 6 morți - aproximativ P 32 aproximativ P 26 aproximativ P 26 B. Kneitz B. Kneitz B. Ledermann 5 băieți, 1 dintre ei himerici 7, 1 himerici înalți (morți) nici unul - aproximativ P 27 B Kneitz nici unul - aprox P 27 B Kneitz none - aprox P 28 B. Kneitz none - cu BL/6, fără transmisie germinală cu BL/6, fără transmisie germinală n - Tab. 2: Prezentare generală a tuturor injecțiilor cu blastocist de clone de celule ES recombinate omolog și complet caracterizate efectuate în timpul acestei teze de doctorat
63 vector pcd22-itim-ko în ceea ce privește legătura SHP-1 întreruptă foarte probabil. 149 39 35 CD22-ITIM-KO 4A1 147 53 48 CD22-ITIM-KO 6D4 140 48 35 CD22-wt Ib.D4 148 37 41 CD22-wt Vb.C3 4 6 Control IgM CD22 a2,6-sia Fig. 18: Expresia la suprafață a CD22 și acidului a2,6-sialic pe clonele J558L-CD22-wt și J558L-CD22-ITIM-KO selectate pentru investigarea fosforilării tirozinei și asocierea SHP-1 a CD22. Expresia markerilor de suprafață este prezentată ca o histogramă, MFI este dat pentru fiecare histogramă.
68 WT CD22 -/- 55,5 89,5 10,5 6,5 95,5 58,7 4,5 2,8 43 67 20,9 33 59,5 92,1 7,9 5,1 B220 + Sialidase NeuGc-SA 63,5