Caracterizarea stării metabolice la primatele neumane cu toleranță intravenoasă la glucoză
rezumat
Scopul acestui protocol este de a prezenta o metodă standard de teste de toleranță intravenoasă la glucoză (IVGTT) pentru efectuarea controlului glicemic la primatele neumane pentru a evalua și a evalua starea lor metabolică de la sănătoasă la dismetabolică.
Abstract
Introducere
IVGTT este un test funcțional convenabil care este utilizat în mod obișnuit pentru a determina funcția celulelor β la om în diferite condiții metabolice 5, 7. În modelele animale de T2D este bine recunoscut ca un instrument pentru caracterizarea animalelor care prezintă de la progresia bolii metabolice o stare sănătoasă până la o stare hiperglicemică dismetabolică 8, 9. Cel mai apropiat model animal de T2D este prezentat la primatele neumane (NHP), dintre care unul este resus și Macacii Cynomolgus sunt exemple notabile. Aceste animale dezvoltă în mod natural T2D cu aceiași factori de risc de vârstă și obezitate care contribuie la incidența sa ca la om 10. În plus, există o progresie similară a bolii și o patologie pancreatică care prezintă depozite de amiloid pe măsură ce boala dismetabolică 11 progresează.
Raportăm aici despre metoda noastră standard pentru producerea unui IVGTT în NHP ca parte a caracterizării coloniei a stării metabolice a acestor animale. Această metodă este ușoară în comparație cu alte tehnici mai consumatoare de timp și mai costisitoare 2. IVGTT este util pentru caracterizarea rapidă și frecventă a unei colonii mari de animale. Atunci când este luat în considerare cu nivelurile de hemoglobină glicată (HbA1C), dieta animalului și istoricul aportului alimentar, precum și procentul de masă musculară și grăsime corporală, IVGTT este de obicei suficient pentru caracterizarea stării metabolice a unui animal și a progresiei către diabetul evident 8.
HbA1C reprezintă nivelul glicemic mediu pe durata de viață a celulelor roșii din sânge, oferind o măsură sigură a nivelului de glucoză în ultimele șase săptămâni până la trei luni. Atunci când este măsurată din proba de sânge bazată pe post de IVGTT, această valoare oferă o fereastră către controlul glicemic în lunile dintre proceduri. Dacă animalul a trecut de la dismetabolică de la ultimul IVGTT, o valoare HbA1c mult mai mare decât valoarea diabetică anterioară ar însemna că tranziția a început imediat după ultima IVGTT, în timp ce o valoare HbA1c mai apropiată de valoarea anterioară ar indica faptul că au trecut recent. De obicei, în macacii rhesus, nivelurile de HbA1C mai mari de 6% sunt anormale și sugerează un control slab al zahărului din sânge 10, 23.
Nivelurile glicemice ar trebui interpretate în funcție de comportamentul și starea generală de sănătate a animalului în ansamblu. Macacii diabetici - ca și oamenii - prezintă hiperfagie, polidipsie și poliurie. Găzduirea în grup a animalelor prezintă provocări semnificative pentru măsurarea acestor indicatori și îngrijirea individuală necesară maimuțelor dismetabolice și diabetice. Recomandăm adăpostirea animalelor în mod individual, astfel încât să se poată asigura mai multă îngrijire personală, iar markerii comportamentali pentru sănătatea maimuței să poată fi monitorizați mai ușor 8. În plus, macacii diabetici vor prezenta pierderea în greutate, un profil lipidic crescut (colesterol crescut, hipertrigliceridemie) și metabolizarea minerală afectată în chimia serică. Este important să se măsoare markerii funcției ficatului și rinichilor în chimia serică, deoarece leziunile acestor organe progresează adesea din cauza complicațiilor tulburare metabolică/diabet și împreună pot fi determinanți ai dezechilibrelor glicemice, lipidice și minerale 9, 11, 18, 24, .
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Protocol
Toate procedurile la animale ale Institutului de Cercetare David H. Murdock IACUC situat în Campusul de Cercetare din Carolina de Nord (NCRC) au fost aprobate, în temeiul Protocolului 14-017, Caracterizarea unui model non-uman de primate de diabet și rezistență la prediabete/insulină și eficacitatea terapiei în îmbunătățirea sensibilității la insulină și funcția metabolică.
1. Selecția animalelor și pregătirea studiului
2. Sedarea și pregătirea animalelor
NOTĂ: Procedura IVGTT constă în 8 puncte de prelevare a sângelui în timp (Tabelul 1).
Cu 100 mg/dl mai mare decât nivelurile inițiale de glucoză plasmatică la jeun.
4. Salvarea animalelor și prelucrarea probelor
- Îndepărtați canulele și aplicați presiune pe locurile cateterizate pentru hemostază după punctul de timp T30 min. Monitorizează animalul până când își recapătă cunoștința și se așează. Oferiți furaje odată ce animalul și-a revenit complet.
- Imediat după aceea, fiecare probă de sânge întreg se află în tuburi K2 EDTA pe gheață. Centrifugați la 3000 de rotații pe minut la o temperatură de 4 ° C în decurs de 10 minute de la colectare. Alicotați probe de plasmă în crioviale, congelați și depozitați la -80 ° C până la analiză.
- Lăsați sângele din tubul seric pentru analiza chimică a serului standard să stea la temperatura camerei timp de cel puțin 20 de minute și nu mai mult de 30 de minute înainte de centrifugare la 3000 rpm la RT. Se congelează probele de ser până când sunt examinate în termen de 48 de ore de la colectare.
NOTĂ: Sângele integral răcit colectat pentru analiza CBC până la 24 de ore de la colectarea Sayed.
- Lăsați sângele din tubul seric pentru analiza chimică a serului standard să stea la temperatura camerei timp de cel puțin 20 de minute și nu mai mult de 30 de minute înainte de centrifugare la 3000 rpm la RT. Se congelează probele de ser până când sunt examinate în termen de 48 de ore de la colectare.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Rezultate reprezentative
Rezultatele sunt în ilustrația 1 Sunt prezentate curbe tipice demonstrative de glucoză și insulină de la macacii cynomolgus maturi, sănătoși și diabetici pe parcursul a 30 de minute de IVGTT. Datele de la maimuțele diabetice sănătoase și avansate sunt prezentate pentru a contrasta diferențele aparente dintre animale de la cele două capete extreme ale gamei de caracterizare metabolică. Acest protocol IVGTT a fost utilizat cu succes de către autori în macacii rhesus cu rezultate similare.
Nivelurile inițiale de glucoză de bază ale unui macac sănătos (rhesus și cinomolgus) pot fi de până la 50 până la 60 mg/dl 8. Așa cum se arată în figură, excursia inițială a glucozei - măsurată la T3 - pentru un NHP sănătos poate să nu urce la fel de mare ca valoarea inițială a glucozei de bază pentru un animal diabetic, care este în mod frecvent mai mare de 200 mg/dL. Pe parcursul următoarelor treizeci de minute, nivelul glucozei revine adesea la valoarea inițială la un animal sănătos, în timp ce animalele dismetabolice și diabetice nu (Ilustrația 1; linii solide). Curba de insulină însoțitoare pentru un animal sănătos prezintă două vârfuri (Ilustrare 1; linie punctată albastră), care corespund scăderii inițiale, rapide a zahărului din sânge (faza 1) mediată într-o parte mai mare decât cea normală de efectele periferice ale insulinei asupra transportului și aportului de glucoză 3, 4. magnitudinea acestor efecte periferice, chiar și în timpul primului Faza răspunsului la insulină, scăderea nu este egală cu contribuția ficatului la glucoză, care, în timpul celui de-al doilea vârf de insulină mai mic, dar susținut (faza 2), are cel mai mare impact asupra nivelurilor glicemice prin suprimarea producției endogene de glucoză 1.
Pe măsură ce un animal progresează spre dismetabolic de la sănătos, există de obicei o diminuare în prima fază a răspunsului insulinei la bolusul de dextroză, care într-o reducere aer poate fi reflectat. Însă ASC rămân neschimbate, deoarece va exista o creștere generală a producției de insulină mai frecvent, asigurând niveluri glicemice în mare parte neschimbate pe parcursul procedurii, deoarece producția crescută de insulină compensează scăderea sensibilității. Odată ce un animal a devenit evident diabetic, producția de insulină scade dramatic ca răspuns la bolusul de dextroză (1; linie roșie punctată). Nivelurile glicemice vor rămâne ridicate pe parcursul procedurii, la fel cum eliminarea glucozei are loc aproape în totalitate prin mecanisme non-dependente de insulină (1), este transmis.
| Timp | Timpi (min) | Timp real | Cantitatea probei de sânge (ml) | Test - exemplu | Citirea glucometrului (mg/dl) | |
| De bază | 5 ml | 1,5 ml SST - chimie 0,5 ml K2 EDTA - CBC, HbA1c 3 ml K 2 EDTA + 50 ul Prot -. Glucoza, insulina, C-Pep | ||||
| 0 | Infuzie de dextroză de 250 mg/kg IV administrată timp de 30 de secunde, urmată de 5 ml de soluție salină de heparină | |||||
| 3 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Glucoză, Ins, C-Pep | ||||
| 5 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Glucoză, Ins, C-Pep | ||||
| Al 7-lea | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Glucoză, Ins, C-Pep | ||||
| 10 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Glucoză, Ins, C-Pep | ||||
| 15 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Glucoză, Ins, C-Pep | ||||
| 20 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Glucoză, Ins, C-Pep | ||||
| 30 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Glucoză, Ins, C-Pep | ||||
masa 1:. Tabelul procedurii IVGTT Este prezentat un raport de procedură standard pentru un IVGTT, care include toate informațiile relevante în timpul procedurii. Timpii pentru aspirațiile de probă după perfuzia cu dextroză trebuie calculați de la sfârșitul perfuziei. Timpii efectivi ar trebui să fie înregistrați pentru fiecare extragere. Faceți clic aici pentru a descărca acest tabel ca document Microsoft Word .
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Discuţie
IVGTT evaluează capacitatea de eliberare a insulinei stimulată de glucoză printr-o singură perfuzie de dextroză pe baza greutății corporale 5, 12, 13. Din test, se atinge nivelul glicemiei și al insulinei în post și permite o evaluare a capacității animalului de a elibera insulină și readuce nivelul crescut de glucoză la valoarea inițială. Acest lucru oferă utilizatorului informații pentru a caracteriza animalul ca fiind un control sănătos normal al nivelului de glucoză și insulină, un animal dismetabolic hiperinsulinemic cu normoglicemie sau un animal diabetic hiperglicemic rezistent la insulină.
IVGTT-urile sunt limitate de capacitatea lor de a măsura direct sensibilitatea la insulină. Este util în primul rând ca metodă de evaluare a producției de insulină și a clearance-ului glucozei. Cu toate acestea, extracția de insulină hepatică din aportul de sânge portal afectează măsurătorile „secreției de insulină” din aportul sistemic de sânge. Cu toate acestea, acest lucru poate fi parțial depășit prin măsurarea peptidei C, care este secretată în cantități echimolare din pancreas, dar nu este îndepărtată de ficat înainte de intrarea alimentării generale cu sânge. Acest lucru oferă o imagine mai bună asupra producției de insulină pentru a evalua funcția mai bună a celulelor β 16. IVGTT, de asemenea, nu diferențiază între mecanismele de eliminare a glucozei dependente de insulină și mecanismele non-dependente de insulină 1, 6. În timp ce sensibilitatea la insulină poate fi evaluată indirect prin modelarea minimă a datelor dintr-un IVGTT, se pot obține măsuri mai fiabile prin utilizarea unor metode precum perfuzia gradată de glucoză. (GGI), care oferă o curbă 14 - doză-răspuns celule β, 15.
Cu toate acestea, sensibilitatea la insulină este evaluată doar indirect cu GGI. O doză standard de insulină poate fi administrată animalului în timpul IVGTT pentru a îmbunătăți evaluarea sensibilității la insulină, dar aceasta va masca producția endogenă de insulină din afectarea evaluării funcției celulelor β. Tehnicile de fixare hiperglicemiantă și hiperinsulinemică măsoară direct reglarea glucozei prin expunerea controlată la insulină. Dezavantajul atât al tehnicilor GGI, cât și al tehnicilor de fixare este că sunt costisitoare de realizat și necesită mai multă forță de muncă și timp (uneori până la șase până la opt ore, în funcție de proiectarea procedurii) pentru a fi finalizate. IVGTT, pe de altă parte, poate poate fi efectuat sub o oră și cu o muncă minimă.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Dezvăluiri
Autorii sunt asociați activ cu un institut de cercetare contractuală (Crown Bioscience) din domeniul bolilor metabolice.