Citopatii mitocondriale - PDF Descărcare gratuită
Citopatii mitocondriale Prelucrarea diferitelor patogeneze ale citopatiilor mitocondriale selectate folosind două studii de caz de Christian Haverkamp
Citopatii mitocondriale Prelucrarea diferitelor patogeneze ale citopatiilor mitocondriale selectate pe baza a două studii de caz Disertație aprobată de Facultatea de Medicină din Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen pentru obținerea diplomei academice de Doctor în Medicină prezentată de Lars Christian Arndt Simon Haverkamp de la Universitatea Duisburg Reporter: rer. nat. Gerhard Buse Domnul profesor universitar Dr. med. J. Michael Schröder Ziua examenului oral: 13 iunie 2008 Această disertație este disponibilă online pe site-ul bibliotecii universității
Cuprins 1 Introducere. 4 1.1 Mitocondriile. 4 1.1.1 Fosforilarea oxidativă (OXPHOS). 4 1.1.2 Specii de oxigen reactiv. 5 1.1.3 Apoptoza. 5 1.2 Structura și organizarea ADN-ului mitocondrial (mtdna). 6 1.3 Boala mitocondrială primară. 8 1.3.1 Mutații punctuale ale mtdna. 8 1.3.2 Ștergerile mtdna. 11 1.4 Mitocondropatii secundare. 11 1.5 Cardiomiopatia primară. 12 1.5.1 Defecte ale genei nucleare. 12 1.5.2 Defecte genetice mitocondriale. 15 2 Scopul lucrării. 19 3 Material și metode. 20 3.1 Originea probelor de țesut. 20 3.1.1 Comenzi. 20 3.1.2 Pacient p1/p2. 20 3.1.3 Pacient p3. 21 3.1.4 Pacient p4. 21 3.2 Pregătirea ADN-ului mitocondrial. 25 3.2.1 Izolarea mtdna din sânge. 25 3.2.2 Izolarea mtdna din țesutul muscular. 26 3.2.3 Liza organică. 27 3.2.4 Extracția fenolului/cloroformului. 27 3.3 Electroforeza pe gel. 27
3.3.1 Electroforeza pe gel de agaroză. 27 3.3.2 Electroforeză pe gel de acrilamidă. 28 3.4 PCR. 30 3.4.1 PCR convențional. 30 3.4.2 -PCR la distanță (LPCR). 32 3.5 Secvențierea. 33 3.5.1 Purificarea ADN-ului. 34 3.5.2 Reacție de secvențiere. 34 3.5.3 Pregătirea probelor pentru măsurare automată. 34 3.5.4 Evaluarea măsurătorii. 35 3.6 Restricție Fragment Lungime Polimorfism (RFLP). 35 3.6.1 MERRF: Ban-II A8344G. 35 3.6.2 MELAS: Apa-1 A3243G. 35 3.6.3 LEIGH: Msp-I T8993C/G. 36 3.6.4 LHON: SfaN-I 11778A/Mae-III 11778A. 36 3.7 Soluții și tampoane. 37 4 rezultate. 40 4.1 LHON. 40 4.1.1 Pregătirea. 40 4.1.2 PCR. 40 4.1.3 Analiza restricțiilor. 40 4.2 Cardiomiopatii. 42 4.2.1 Pregătirea micromusculară. 42 4.2.2 Pregătirea. 43 4.2.3 screening-ul ștergerii LPCR. 43 4.2.4 Secvențierea. 45 5 Discuție. 47 5.1 LHON. 47
5.1.1 Patogenie. 47 5.1.2 Terapia citostatică. 51 5.1.3 Literatură și evaluare finală. 54 5.2 Cardiomiopatia. 56 5.2.1 Comunicarea intergenomică. 56 5.2.2 Semnificația modificărilor constatate. 65 5.2.3 Rezumat. 67 6 Directoare. 69 6.1 Lista tabelelor. 69 6.2 Lista figurilor. 69 6.3 Lista abrevierilor. 70 6.4 Bibliografie. 73
1.1 Mitocondrii Condensarea cromatinei și defalcarea cromatinei, în care este implicată și CAD. Deschiderea porului de tranziție a permeabilității mitocondriale (mtptp) pare să ducă la o prăbușire a gradientului electrochimic, la umflarea membranei interioare și la ruperea membranei externe. Mtptp pare a fi compus din translocatorul de andenozină nucleotidă (ANT), porină și alți factori precum Bax (proteina X asociată BCL2), Bcl2 (leucemie cu celule b/limfom 2), ciclofilină D și receptorul benzodiazepinei. Deschiderea este probabil cauzată de expunerea crescută la ROS, scăderea Ψ sau aportul excesiv de calciu.2-9 Figura 1: Căi metabolice importante în mitocondrie 1.2 Structura și organizarea ADN-ului mitocondrial (mtdna) Mitocondriile sunt sub controlul a doi genomi. Majoritatea proteinelor structurale și funcționale mitocondriale sunt codificate de nucleu, traduse în citosol și transportate în mitocondrie printr-o secvență de recunoaștere. 13 subunități proteice, 22 trnas și 2 rrnas sunt codificate de un genom mitocondrial. Proteinele fac parte exclusiv din lanțul respirator: citocromul b, subunitățile 1, 2 și 3 ale citocromului c-oxidazei, a 6-a
1.2 Structura și organizarea ADN-ului mitocondrial (MTDNA) Afectează în principal bărbații la vârsta lor medie. În prezent, există 18 mutații cunoscute în ADN-ul mitocondrial care cauzează boala singur sau în combinație. 1.3.1.1.1 Caracteristici clinice Simptomele încep de obicei la mijlocul vieții cu o pierdere de câmp vizual central nedureroasă, acută până subacută. Fundoscopic, un 8
3,6 g țesut, care este împărțit în porțiuni de aproximativ 100 mg. Această porțiune este apoi tratată ca o micropreparare 26, individuală
3.2 Pregătirea ADN-ului mitocondrial Peletele mitocondriale sunt combinate. Pregătirea maxi este utilizată pentru a obține șabloane de control. Materialul pacientului este de ordinul
3.4 Primeri PCR înainte și invers (MWG Biotech) și 1350 µl Aqua steril. Condițiile PCR pentru fragmentele individuale sunt enumerate în Tabelul 5 și Tabelul 6. Pentru fragmentele respective, condițiile PCR diferă în ceea ce privește temperatura de recoacere, timpul de extindere și numărul de cicluri. Temperatură în grade Celsius Timp în secunde Prima denaturare 94 300 Denaturare 94 30 Tan de recocere 60 Extensie 72 Text Tabel 5: Profil PCR de bază 31
3.6 Restricție Fragment Lungime Polimorfism (RFLP) 3.6.3 LEIGH: Msp-I T8993C/G Mutația LEIGH T8993C și T8993G este detectată prin analiza RFLP a fragmentului 7. Modelul de restricție al Msp-I (Gibco BRL) cu situsul de clivare C ^ CGG pentru acest fragment este prezentat în FIG. MELAS: A3243G de tip sălbatic MERRF: mutație A8344G de tip sălbatic 3001 Leigh: mutație T8993C/G mutație de tip sălbatic 7415 8363 246bp 3247 1431bp 839bp 839bp 629/630bp 842bp 1185bp 41bp 8254 41bp 8295 4432 68bp 8347 9205 Figura 3: Reprezentarea schematică a modelului de restricție 3.6.4 LHON: SfaN-I 11778A/Mae-III 11778A Două teste diferite sunt disponibile pentru analiza RFLP a mutației LHON 11778. Mutația LHON are ca rezultat eliminarea unui situs de scindare pentru restricția F10 cu SfaN-I și un nou situs de scindare pentru restricția Mae III. Utilizarea ambelor metode de testare reduce riscul unui rezultat fals negativ sau fals pozitiv. 36
3.6 Restricție fragment lungime polimorfism (RFLP) SfaN I restricție: GATGC 11450 997 122 12570 122 12570 LHON 11450 318 679 tip sălbatic Figura 4: Restricție model LHON 11778 cu SfaN I Mae III restricție: 11450 200 ^ GTNAC 125 130 58 607 12570 60750 12570 LHON 255 58 Tip sălbatic Figura 5: Model de restricție LHON 11778 cu soluții MAE III 3.7 și tampon Mix master specific pentru fragment (PCR) 5,55% grund înainte (8 pmol/100 µl) 5,55% grund invers (8 pmol/100 µl) 1,11% polimerizare -Amestecați 11,11% tampon Taq de 10 ori 76,66% Aqua tampon steril de hemoliză 37
3.7 Soluții și tampoane 10 mm NH4HCO3 144 mm NH4Cl H tampon 210 mm manitol 70 mm zaharoză 1 mm EDTA 5 mm HEPES (soluție 1M) 0,5% tampon de încărcare a albuminei (geluri de agaroză) 15% Ficoll 50 mm EDTA 0,5% SDS 1x TBE 0,1% (g/g) albastru de bromofenol 0,1% (g/g) tampon de încărcare xilen cianol (geluri de poliacrilamidă) 98% formamidă deionizată 10 mm EDTA, pH 8,0 0,025% albastru de bromofenol 0,025% xilen cianol tampon zaharoză 250 mm zaharoză 38
3.7 Soluții și tampoane 10 mm TrisCl pH 7,4 1 mm EDTA SDS soluție (0,1%) 0,1% SDS 1 mm EDTA 10xTBE 1M Tris-HCl 0,83 M acid boric 10 mm EDTA ajustat la pH 8,3 Tampon TE 10 mm TrisCl, pH 8,0 1 mm EDTA 39
4.1 LHON Acest nou site de scindare este cauzat de mutația LHON la poziția 11778. Nu există reziduuri ale benzii de tip sălbatic (255 pb). L K p1 L 607 bp 255 bp 200 bp 125 bp și 130 bp Figura 6: Gel de agaroză pentru separarea fragmentelor de restricție Mae III Mama pacientului p2 poartă, de asemenea, mutația homoplasmică în ambele rânduri de celule. Figura 7 prezintă digestia fragmentului 10 (prepararea leucocitelor) cu enzima de restricție SfaN1. Controlul (K) prezintă 3 benzi (679 bp, 318 bp și 122 bp). În fragmentul 10 examinat (p2), a fost omis un loc de scindare la poziția 11778; benzile 679 bp și 318 bp sunt absente. În schimb, apare o bandă de 997 bp. Acest rezultat este în acord cu digestia cu Mae-III, care nu este prezentată aici. 41