De la clinica obstetrică

1 De la Clinica de Obstetrică a Facultății de Medicină a Charité Universitätsmedizin Berlin DISSERTARE Th 1 -citokine și protrombinază fgl2 în sarcină normală și patologică Depusă la Facultatea de Medicină Charité a Universității Humboldt pentru a obține diploma academică de Doctor medicinae (Dr. med.) Berlin de Maike Knackstedt din Berlin

2 decani: prof. Dr. med. J.-W. Dudenhausen Prof. Dr. med. Matin Paul Recenzor: 1. Prof. Dr. med. J.-W. Dudenhausen 2. Prof. Dr. med. habil. H. Donat 3. Prof. Dr. med. G. Schönfelder Data doctoratului: 24 septembrie 2004

3 Cuprins 3 Cuprins Lista abrevierilor 5 Obiective 6 1 Introducere Bazele implantării unui embrion Începutul sarcinii Modelul de transplant Implantarea patologică Bazele imunologice ale sarcinii Paradigma Th 1/Th 2 Rolul citokinelor Th 1 în sarcină Consecințele dezechilibrului imunologic în sarcină Activarea sistemului de coagulare Rolul apoptozei în sarcină Aspecte ale avortului spontan Principii imunologice ale avortului spontan Două modele de avort la șoareci CBA/J: stres versus aspecte imunologice ale preeclampsiei Întrebarea 21 2 Material și metode Testare animale Colectiv pacient Configurare experimentală a experimentelor pe animale Rată de avort în procente Pregătirea țesutului Extracția totală a ARN-ului Tratamentul ADN-ului probelor de ARN Transcriere inversă PCR calitativă Electroforeză la agaroză Analiza PCR cantitativă a datelor Taq-Man Pregătirea ADN-ului plasmidic în liniarizare la scară mică (mini pregătire) a sintezei ADNc plasmidice a sondei ARN marcate cu 35 S hibridizare in situ imunohistochimie colorare TUNEL colorare Giemsa colorare analiză statistică a datelor 41

4 Cuprins 4 3 Rezultate Creșterea ratei avortului prin stres și prin injectarea IL-12 p Influența stresului asupra expresiei mrna a citokinelor abortogene Creșterea mrna TNF-α după expunerea la stres Expresia IFN-γ după aplicarea stresului Influența expresiei mrna a IL-12 prin stres Raportul dintre rata avortului și cantitatea cantitativă de citokine Profilul citokinelor după injectarea IL Compararea expresiei mrna fgl2 sub stres și după injectarea IL Inducerea apoptozei prin stres și IL -12 în modelul mouse-ului Expresia TNF-α în primul trimestru și al treilea trimestru Exprimarea proteinei fgl2 mrna și fgl2 în țesutul placentar uman Primul trimestru Al treilea trimestru Apoptoza în preeclampsie și avort spontan 59 4 Discuție 61 5 Rezumat 72 6 Lista publicațiilor 74 7 Anexă 91

5 Listă de abrevieri 5 Listă de abrevieri// Creștere/Micșorare/constantă ASA Acid acetilsalicilic CD Cluster de diferențiere ADN Acid dezoxiribonucleic (A = acid) COX Ciclooxigenază EGF Factor de creștere epidermică fgl2 Fibrinogen-ca-Proteină 2 HLA-Human-Leucocil Transferază IDO Indolamină-2,3-Dioxigenază IFN-γ Interferon-gamma IL Interleukin IRF Interferon-Regulator-Factor LIF Leucemie-Factor inhibitor LPS Lipopolizaharidă MHC Major-Histocompatibilitate-Complex MHV3 Hepatită murină-Virus MIP Macrofag-Inflamator-Protein mrna (mesager) acid ribonucleic (A = acid) Celule NK/celule uNK Celule ucigașe naturale/celule NK uterine NO oxizi nitric NOS (inos) oxid nitric sintază (oxid nitric sintază inductibil) OX orexin = CD 200 PAI inhibitor al activatorului plasminogenului PCR polimerază reacție în lanț PE preeclampsie PMNL polimorfonucleare leucocite RT transcriptază inversă TGF transformare factor de creștere Th T celulă ajutătoare TNF-α factor de necroză tumorală-alfa VEGF factor de creștere endotelial vascular

6 Obiectiv 6 Obiectiv Obiectivul acestei teze este de a 1 în modelul de șoarece cu combinația de împerechere CBA/J-femele și DBA/2J-bărbați diferențele în profilul citokinei uterine și rolul proteinei fibrinogene asemănătoare protrombinazei 2 (fgl2 scurtă) în indus de stres și avortul inflamator. 2 caracterizează profilul citokinelor în legătură cu o posibilă activare a sistemului de coagulare prin fgl2 ca protrombinază în țesutul decidual al pacienților cu sarcină normală și al pacienților din primul trimestru cu avort. 3 pentru a descrie expresia citokinelor Th 1 și a fgl2 în țesutul placentar de la pacienții cu un curs de sarcină necomplicat și la pacienții cu preeclampsie în trimestrul trei.

22 Introducere 22 Complicații în timpul sarcinii Sunt examinate avortul spontan și preeclampsia și legătura cu un dezechilibru imunologic.

25 Material și metode 25 Resorbția implantării Figura 3: Reprezentarea unuia dintre coarnele laterale ale uterului de șoarece în formă de V Două implantări () și două resorbții () sunt prezentate într-un uter de șoarece în ziua 13.5 a gestației, așadar se află în cornul lateral al uterului prezentat mai sus o rată de avort de 50%. 2.5 Pregătirea țesuturilor Pentru investigațiile biologice moleculare, 100 mg de țesut uterin au fost preparate din locurile implantărilor reușite și spălate cu atenție cu PBS steril (pH = 7,4) și apoi congelate imediat folosind azot lichid și depozitate la 80 C până când ARN-ul a fost izolat. Nu s-au prelevat probe de țesut din partea absorbției, deoarece țesutul s-a descompus deja hemoragic și necrotic, iar testele de probă au arătat că acest țesut nu este potrivit pentru diagnosticul de citokine. 2.6 Extracție totală a ARN Material: Trizol Cloroform Etanol (100%, 75%) Gel de agaroză 1,5% Bromură de etiduim (10 mg/ml) Centrifugă de despergierstare (5415C) Gibco BRL, Karlsruhe, D Merck, Darmstadt, D Merck, Darmstadt, D Biozym, Oldendorf, D Gibco BRL, Karlsruhe, DT 8.10, IKA Labortechnik Eppendorf, Hamburg, D

31 Material și metode 31 (hipoxantină fosforibozil transferază) obținute ca genă de referință. Sondele au fost toate verificate pentru specificitatea lor pentru ADNc, adică ADN-ul genomic nu a fost amplificat. Secvențe primare: Murines HPRT: Ex 7.8: 5 -gttggatacaggccagactttgt Reverse: 5 -CACAggACTAgAACACCTgC Murines IFN-γ: Forward: 5 -CagCAACAACATAAgCgTCAT Reverse: 5 -CTCCTTTTCCgCTTCCTgAgtgerse TNG Murines fgl2: Înainte: 5 -CAACAgTTTggATggCAAgTg Reverse: 5 -CTTTgTATATTAgATgAACCgg Murines IL-12 p40: Înainte: 5 -TTCAgTgTCCTgCCAggAgg Înapoi: 5 -CgggTCTCCGGTTTGATgATg HPRT: 5-6FAM-TTgCAgATTCAACTTgCgCTCA XT CTT p PCR temperature: 60 C or 63 C Murines IFN-γ: 5-6FAM-TTCCggCAACAgCTggTggACCAC XT p PCR temperature: 60 C Murines TNF-α: 5-6FAM-gTAgACAAggT Temperatura PCR: 63 C Murines fgl2: 5-6FAM-gTgTCCCAgCCAAgAACACA XT gca p Temperatura PCR: 63 C

41 Material și metode Analiza statistică a datelor Pentru evaluarea semi-cantitativă a imunohistochimiei, a fost utilizată o scală ordinală cu ratingurile +/++/+++. Pentru analiza statistică a acestor date, testul Mann-Whitney U a fost utilizat ca test non-parametric pentru probe independente. Datele sunt prezentate grafic în graficele casetei. PCR în timp real a fost evaluat așa cum s-a descris mai sus. După un test aproximativ pentru distribuția normală, datele au fost evaluate cu testul Student s T și prezentate în grafice cu bare cu deviație standard.

47 Rezultate 47 La fel, IL-12 p40 (r = 0,24) și IL-12 p35 (r = -0,29) nu prezintă nicio legătură cu proporția de resorbții (Figura 11 și Figura 12)% din avorturi r = IL-12 p40mrna Figura 11: Corelația dintre procentul de avorturi și cantitatea de IL-12 exprimată p40 mrna Nu există nicio corelație între cantitatea de IL-12 p40 și procentul de resorbții% de avorturi r = IL-12 p35 mrna Figura 12: Relația dintre rata avortului în procente și cantitatea de IL-12 p35 mrna exprimată Nu există nicio corelație între cantitatea de IL-12 p35 și procentul de resorbții.

48 Rezultate Profilul citokinelor după injectarea IL-12 Întrebarea este dacă IL-12, ca citokină activă cu celule T, poate induce un răspuns imun Th 1 la șoarece, ceea ce duce apoi la o creștere a ratei avortului. După injectarea IL-12, măsurătorile au arătat o creștere de 9,5 ori a IFN-γ mrna (Figura 13). Interesant este că IL-12 recombinant injectat a avut, de asemenea, o influență asupra expresiei TNF-a: După injecție, expresia mrna TNF-a a crescut de 8,8 ori (Figura 13). După stimularea de către IL-12 a existat în consecință o constelație de citokine comparabilă cu prezența simultană a unor cantități mari de TNF-α și IFN-γ, ca și în cazul injectării simultane a ambelor citokine: 10 8 ori mrna n = 5 n = 7 n = 7 martori, fără injecție IFN-γ mrna după injecție IL-12 TNF-α mrna după injecție IL-12 Figura 13: Reglarea citokinelor după injectarea IL-12 p70 Creștere semnificativă a TNF-α și IFN-γ după Injectarea IL-12 p recombinantă Compararea expresiei mRNA fgl2 sub stres și după injectarea IL-12. Hibridizarea in situ arată histologic localizarea mrna fgl2 în uterul șoarecilor CBA/J în ziua 13.5 a Sarcina (Figura 14).

50 Rezultate 50 S-a constatat, totuși, că cantitatea de TNF-α mrna este legată negativ de cantitatea de fgl2 mrna (Figura 16). Nu a existat o relație statistic clară între fgl2 mrna și IFN-γ mrna (Figura 17). 9,5 9,0 TNF-α mrna 8,5 8,0 7,5 7,0 r = Fgl2 mrna 6 8 Figura 16: Relația dintre cantitatea de TNF-α și cantitatea de fgl2 mrna Nu prezintă nicio importanță Corelația dintre cantitatea de TNF-α și cantitatea de fgl2 mrna, o relație negativă între cei doi parametri poate fi văzută ca o tendință. 14 IFN- γ mrna r = 0, Fgl2 mrna 6 8 Figura 17: Relația dintre cantitatea de IFN-γ mrna și cantitatea exprimată de fgl2 mrna Nu există nicio corelație între cantitatea de IFN-γ și cantitatea de fgl2 mrna.

53 Rezultate 53 A B Figura 20: Imunohistochimie pentru TNF-α în placenta trimestrului 3 cu sarcină normală (A) prezintă controlul IgG și (B) prezintă colorarea pentru proteina TNF-α. Un vas cu trofoblast B Figura 21: Imunohistochimie pentru TNF-α în placenta trimestrului 3 al pacienților cu preeclampsie (A) prezintă controlul IgG și (B) prezintă colorarea pentru proteina TNF-α. Tabelul 1 prezintă analiza specifică a celulelor TNF-α proteine pozitive din preeclampsie: Originea țesutului Endoteliu Trofoblast Macrofage placentare PE (n = 10) +/++ + +/++ Control (n = 12) + +/- +/++ Tabelul 1: Imunohistochimie pentru TNF-α în placenta trimestrului III în sarcina normală și la pacienții cu preeclampsie Exprimarea crescută a proteinei TNF-α în celulele endoteliale și trofoblaste în preeclampsie (PE) comparativ cu sarcina normală. Nicio diferență în expresia proteinei TNF-α în celulele trofoblaste și macrofage placentare.

54 Rezultate Exprimarea proteinei fgl2 mrna și fgl2 în țesutul placentar uman Primul trimestru Figura 22 prezintă datele obținute prin hibridizare in situ. A B Figura 22: Hibridizare in situ pentru fgl2 mrna villusul primului trimestru (A) prezintă controlul senzorial și (B) prezintă colorarea antisens pentru fgl2 mrna. Sunt prezentate vilozități placentare cu stratul de trofoblast cu două celule constând din sincitiotrofoblaste și citotrofoblaste care sunt caracteristice primului trimestru. Hibridizarea in situ a fost efectuată folosind o sondă mrna fgl2 marcată cu 35 S. În ambele vilozități prezentate, există un marcaj tipic, negru, al stratului de trofoblast în proba antisens, proba mrna fiind o imagine în oglindă a secvenței fgl2 mrna. În controlul negativ, eșantionul de sens, în care eșantionul este identic cu secvența fgl2-mrna, nu există semnal pozitiv. Trofoblastul prezintă, de asemenea, semnale pozitive (maro) pentru proteina fgl2 în imunohistochimie (Figura 21).

55 Rezultate 55 A B Figura 23: Imunohistochimie pentru fgl2 în placenta trimestrului I cu sarcină normală (A) prezintă controlul IgG și (B) prezintă colorarea proteinei fgl2 și o secțiune reprezentativă a vasului. Aceste rezultate arată pentru prima dată că fgl2 mrna și proteina fgl2 sunt exprimate în celulele trofoblaste umane, mai ales dacă a avut loc un avort spontan. Numărul de vase pozitive fgl2 în numărul total de vase a crescut dacă a avut loc un avort spontan (Figura 24). Vase pozitive Fgl2/numărul total de vase 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 n = 6 * n =% median 25% controlul avortului spontan Figura 24: expresia proteinei fgl2 în celulele endoteliale ale Navele în primul trimestru Analiza semicantitativă a imunohistochimiei pentru fgl2 pe vasele din decidua bazală de control și avort spontan.

56 Rezultate 56 Evaluarea semicantitativă a expresiei fgl2 a trofoblastelor zotice arată că pacienții cu avort au o expresie fgl2 mai mare decât pacienții cu întreruperea electivă a sarcinii (Figura 25). Intensitatea colorării trofoblastelor zottice pozitive fgl2 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 n = 6 * n = 9 75% median 25% controlul avortului spontan Figura 25: expresia proteinei fgl2 în trofoblaste din primul trimestru Analiza semicantitativă a imunohistochimiei pentru fgl2 pe celulele trofoblaste din decidua bazală în martor și avort spontan AB trofoblaste de vas Figura 26: Imunohistochimie pentru fgl2 în placenta trimestrului I al pacienților cu avort (A) arată controlul IgG și (B) prezintă colorarea proteinei fgl2 și o secțiune reprezentativă a vasului.

58 Rezultate 58 Următoarea figură 28 prezintă vilozități mature ale unei placente în al treilea trimestru cu un curs normal de sarcină. Celulele trofoblaste exprimă ocazional proteina fgl2 (Figura 26 B). Figura 29 prezintă placenta unui pacient cu preeclampsie, trofoblastele exprimând proteina fgl2 mai omogen. Vase A B Figura 28: Imunohistochimie pentru fgl2 în placenta trimestrului 3 cu sarcină normală (A) prezintă controlul IgG și (B) prezintă colorarea proteinei fgl2. A B Figura 29: Imunohistochimie pentru fgl2 în placenta trimestrului 3 al pacienților cu preeclampsie (A) prezintă controlul IgG și (B) prezintă colorarea proteinei fgl2. În concordanță cu această observație, s-au putut observa depozite impresionante de fibrină în probele placentare de la pacienții cu preeclampsie, comparativ cu probele placentare în sarcina necomplicată.

59 Rezultate Apoptoza în preeclampsie și avortul spontan Citokinele Th 1, în special TNF-α, sunt capabile să declanșeze moartea celulară programată sub formă de apoptoză. Examinarea semnalelor apoptotice în primul trimestru și în al treilea trimestru a arătat că s-a observat o incidență semnificativ mai mare a apoptozei atât în decidua, cât și în preeclampsie placente (Figura 30). A TUNEL + celule per câmp vizual 2,5 * 2,0 1,5 n = 5 1,0 0,5 5 n = 6 B TUNEL + celule per câmp vizual * n = n =% median 25% 4 control spontane avort control preeclampsia Figure 30: Apoptoza în primul și al treilea trimestru A: Analiza semicantitativă a semnalelor apoptotice în avort spontan. B: Analiza semicantitativă a semnalelor apoptotice în preeclampsie.

60 Rezultate 60 Figura 31 prezintă apoptoza într-o placentă în al treilea trimestru. Figura 31: Apoptoza în al treilea trimestru. Nucleii celulelor sunt colorați în albastru, cu fragmentele apoptotice fluorescente în verde.