Disertație. pentru a obține diploma universitară doctor agriculturarum (Dr. agr.) de la inginerul agricol absolvent Peter Škufca

1 De la Institutul de Științe Nutritive (Director: Prof. Dr. habil K. Eder) al Facultății de Agricultură (Decan: Prof. Dr. agr. Habil W. Merbach) al Universității Martin Luther Halle-Wittenberg Studii experimentale privind influența grăsimilor oxidate privind parametrii selectați ai hormonului tiroidian și metabolismului lipidic la șobolanul model animal Disertație pentru obținerea diplomei universitare doctor agriculturarum (Dr. agr.) de către inginerul absolvent Peter Škufca urn: nbn: de: gbv: [Halle/Saale 2002

2 De la Institutul de Științe Nutritive Investigații experimentale asupra influenței grăsimilor oxidate asupra parametrilor selectați ai hormonului tiroidian și metabolismului lipidic la șobolanul animal model Facultatea de Agricultură a Universității Martin Luther Halle-Wittenberg ca disertație pentru obținerea diplomei universitare doctor agriculturarum (Dr. agr.) prezentat de inginerul agricol absolvent Peter Škufca b. la 6 iunie 1971 la Ljubljana, Slovenia Recenzent: 1. Prof. Dr. habil Eder 2. PD Dr. habil Brandsch 3. Prof. Dr. habil Jareis Dean: Prof. Dr. agr. habil. Apărare W. Merbach la 1 iulie 2002 Halle/Saale 2002

3 Cuprins Lista tabelelor Lista figurilor Lista abrevierilor utilizate Pagina I III IV 1 Introducere 1 2 Material și metode Configurarea testului Investigația influenței grăsimilor oxidate asupra metabolismului lipidic și al hormonilor tiroidieni cu aport diferit de seleniu Compoziția dietei Parametri de analiză Investigații privind influența grăsimilor oxidate asupra hormonului tiroidian 9 și metabolismul lipidic cu aport diferit de iod Compoziția dietei Parametri de analiză Investigații privind influența diferitelor 13 grăsimi tratate termic asupra concentrațiilor hormonilor tiroidieni cu aporturi diferite de vitamina E Obținerea omogenatului hepatic și a citosolului hepatic Metode analitice Determinarea indicelui de grăsime pentru Absc Estimarea celor 20 de grade de oxidare a grăsimilor Numărul de peroxid Numărul de acid 20

9 III Lista figurilor Lista figurilor Cuprins Nr. Page 1 Reacția malondialdehidei cu acid tiobarbituric 21 (conform Valenzuela, 1991) 2 Determinarea timpului de întârziere conform Kleinveld și colab. (1992) 32 3 Principiul determinării indirecte a activității glutation peroxidazei 33 4 Separarea produselor PCR prin electroforeză pe gel de agaroză 50 5 Foliculii tiroidieni în secțiunea transversală 57 6 Mecanismele de acțiune a grăsimilor oxidate asupra ipotezei sintezei hormonului tiroidian 81

16 5 2 Material și metode 4,4% (g/g). Pentru a elimina efectele diferitelor compoziții de acizi grași ai grăsimilor testate, compoziția de acizi grași a uleiului de floarea-soarelui proaspăt a fost ajustată la modelul de acizi grași al grăsimii oxidate prin adăugarea de untură de porc 20%. Acidul linoleic (18: 2 n-6) a fost valoarea de orientare (54,1 g/100 g acizi grași) (Tabelul 1). Tabelul 1: Caracterizarea grăsimilor utilizate în primul experiment Grăsimi inițiale Ulei de floarea soarelui Porc Untură Test grăsimi Sursă de grăsime proaspăt oxidată [g/kg dietă] Ulei de floarea soarelui Porc Untură Temperatura de tratament [C] Timp [săptămâni] Cifre de grăsime Număr de peroxid [meq O 2/kg de grăsime] 2.00-4, TBARS [µmol/kg grăsime] 0,29-0,27 0,34 număr acid [mg KOH/g grăsime] 0,55-0,57 1,44 compoziție de acid gras [g/100 g acizi grași] acid miristic (14: 0) 0, 1 1,6 0,4 0,1 acid palmitic (16: 0) 6,3 26,7 10,6 7,4 acid palmitoleic (16: 1) 0,1 2,3 0,5 0,1 acid stearic (18: 0) 4,0 16,8 6,7 4,7 acid oleic (18: 1) 22,0 38,5 25,4 26,4 acid linoleic (18: 2 n-6) 65,8 9,3 54, 1 54,1 Acid arahidic (20: 0) 0,3 0,0 0,2 0,3 Acid eicosenoic (20: 1) 0,3 0,8 0,4 0,3 Tocoferoli [mg/kg grăsime] α-tocoferol, acetat de tot-rac-α-tocoferol (toleranță) echivalent α-tocoferol [mg/kg], abrevieri: KOH, hidroxid de potasiu; TBARS, substanțe reactive ale acidului tiobarbituric.

21 10 2 Material și metode Tabelul 6: Caracterizarea grăsimilor utilizate în cel de-al doilea experiment Grăsimi de pornire Grăsimi de testare Ulei de floarea soarelui Ulei de palmă Proaspăt oxidat Sursă de grăsimi [g/kg dietă] Ulei de floarea soarelui Ulei de palmier Temperatură de tratament [C] Timp [săptămâni] Cifre de grăsime Număr de peroxid [meq O 2/kg] 2, 0-4, TBARS [µmol/kg] 0,29-0,27 0,34 acid număr 0,59-0,61 1,30 compoziție de acid gras [g/100 g acizi grași] acid miristic (14: 0) 0,1 1, 2 0,2 0,1 acid palmitic (16: 0) 6,3 45,9 10,5 7,4 acid palmitoleic (16: 1) 0,1 0,2 0,1 0,1 acid stearic (18: 0) 4,4 4,5 4,4 4,7 Acid oleic (18: 1) 22,4 37,7 24,3 26,9 Acid linoleic (18: 2 n-6) 66,2 9,5 59,8 60, 1 Acid arahidic (20: 0) 0,3 0,4 0,3 0,3 Acid eicosenoic (20: 1) 0,2 0,2 0,2 0,3 Tocoferoli [mg/kg grăsime] α-tocoferol, toate- rac-α-tocoferol acetat (supliment) echivalent α-tocoferol [mg/kg], abrevieri: TBARS, substanțe reactive la acid tiobarbituric.

25 14 2 Material și metode Tabelul 10: Caracterizarea grăsimilor utilizate în al treilea experiment Grăsime de pornire Grăsimi de test FF Grăsime # 1 Grăsime # 2 Grăsime # 3 Sursa de grăsime [g/kg dietă] Ulei de floarea soarelui Untură de porc Tratament Temperatură [C] Timp [ore] Produse de peroxidare în grăsime Număr de peroxid [meq O 2/kg] 1,6 1,5 TBARS [μmol/kg] 0,08 0,13 10,3 2,18 0,29 compoziție de acid gras [g/100 g acizi grași] acid miristic (14: 0) 0, 8 1,1 0,9 1,0 0,9 acid palmitic (16: 0) 15,2 13,2 17,4 17,8 17,5 acid palmitoleic (16: 1) 1,5 1,3 1,6 1,6 1,5 acid stearic (18: 0) 8,7 11,5 9,8 10,4 10,2 acid oleic (18: 1) 33,4 35,6 36,9 35,6 34,7 acid linoleic ( 18: 2 n-6) 36,6 26,1 26,9 26,6 27,2 acid linolenic (18: 3 n-3) 0,5 0,6 0,3 0,3 0,3 acid eicosenoic (20: 1) 0,7 0,8 0,7 0,7 0,8 Tocoferoli [mg/kg grăsime] α-tocoferol (analizat), 9 all-rac-α-tocoferol acetat Supliment scăzut - 71, Supliment crescut echivalent α-tocoferol [ mg/kg grăsime] (calculat) Valoare redusă Valoare crescută Abrevieri: FF, Grăsime proaspătă; Grăsimi # 1, grăsimi încălzite la 50 C; grăsimi # 2, grăsimi încălzite la 105 C; Grăsime # 3, grăsime încălzită la 190 ° C; TBARS, substanțe reactive ale acidului tiobarbituric.

27 16 2 Material și metode Tabelul 11: Compoziția dietei în cea de-a treia încercare Componentă grasă proaspătă Cantitate [g/kg] oxidată Cantitate [g/kg] Amidon cazeină Zaharoză Grăsime proaspătă din acesta: Ulei de floarea soarelui Untură de porc * 50 * Celuloză Vitamix premix Mineral amestec DL-metionină 2 2 * conținut de ulei de floarea soarelui și untură pentru grăsimi oxidate (grăsimi # 1, grăsimi # 2 și grăsimi # 3). 1 premix de vitamine pe kg de dietă: 4000 I.U. Retinol; 1000 I.U. Colecalciferol; 0,75 mg de bisulfură de sodiu menadionă; 5 mg clorhidrat de tiamină; 6 mg riboflavină; 6 mg clorhidrat de piridoxină; 15 mg pantotenat de Ca-D; 30 mg acid nicotinic; 2,0 mg acid folic; 0,025 mg cobalamină; 0,2 mg biotină; 1000 mg clorură de colină, tărie 16,9 g. 2 premixuri minerale pe kg de dietă: 9,83 g carbonat de calciu; 9,42 g fosfat di-calcic; 4,87 grame de fosfat de magneziu; 10,0 grame de sulfat de potasiu; 0,87 g oxid de magneziu; 2,99 g clorură de sodiu; 0,16 g sulfat de fier; 50,6 mg oxid de zinc; 30,0 mg sulfat de cupru pentahidrat; 24,2 mg oxid de mangan; 0,32 mg iodat de calciu; 0,33 mg selenit de sodiu, zaharoză 1,8 g.

28 17 2 Material și metode Tabelul 12: concentrațiile α-tocoferolului din dietele utilizate și clasificarea grupelor testate în cel de-al treilea test Grupa Tipul de grăsime α-tocoferol acetat α-tocoferol vitamina E Alocație de prescurtare analizată Grupa [mg/kg dietă] [mg/kg dietă] I II proaspăt niciuna 11,6 ± 0,95 25 FF/NE (25 mg/kg dietă) ± 38,1 250 FF/EE III oxidat 25 46,5 ± 2,21 25 OF # 1/NE la IV 50 C ± 30, 4 250 OF # 1/EE V oxidat 25 25,4 ± 4,17 25 OF # 2/NE la VI 105 C ± 40,5 250 OF # 2/EE VII oxidat 25 26,7 ± 1,64 25 OF # 3/NE la VIII 190 C ± 7, OF # 3/EE Abrevieri: FF, grăsime proaspătă; OF # 1, grăsime încălzită la 50 C; OF # 2, grăsime încălzită la 105 C; OF # 3, grăsime încălzită la 190 C; EE, aport crescut de vitamina E; NE, aport scăzut de vitamina E. Tabelul 13: Cifre de grăsimi ale grăsimilor dietetice din al treilea experiment ca parte a dietei finite Grupul POZ [meq O 2/kg grăsime] TBARS [mmol/kg grăsime] I 4,66 0,02 II 4,41 0,00 III, 7 IV, 1 V 329 2,21 VI 224 2,26 VII 39,2 0,15 VIII 37,7 0,21 Abrevieri: POZ, număr de peroxid; TBARS, substanțe reactive ale acidului tiobarbituric.

32 21 2 Material și metode Calculul numărului de acid: AN (mg KOH/g) = 56,1. Consum KOH (ml). Concentrație KOH (N) Greutatea grăsimii (g) Substanțe reactive la acid tiobarbituric Determinarea TBARS sa bazat pe metoda lui Sidwell și colab. (1954), modificat din Halliwell și Gutteridge (1989) și Valenzuela (1991). Această determinare se bazează pe reacția a două molecule de acid tiobarbituric (TBA) și a unei molecule de malondialdehidă (MDA) sub influența căldurii într-un mediu acid (Figura 1). OH CHO O OH N 2 x + CH2 HN NH HS N OH CHO SN OH O NH S TBA MDA Figura 1: Reacția malondialdehidei cu acid tiobarbituric (conform Valenzuela, 1991) Pentru a determina cantitatea de TBARS, o curbă de calibrare cu 1.1, 3,3-Tetraetoxipropan (TEP) creat ca standard. 0,2 g grăsime sau 0,2 ml standard au fost amestecate cu 4 ml cloroform și 4 ml reactiv TBA (0,67% (greutate/volum) în apă distilată, diluat 1: 2 cu acid acetic glacial) și agitat timp de 4 minute. După separarea fazelor, faza apoasă superioară a fost pipetată și încălzită la 95 ° C timp de 30 de minute. Absorbția a fost apoi măsurată la 532 nm în cuve de sticlă. Cantitatea de TBARS în µmol a fost determinată prin intermediul unei curbe de calibrare și legată de 1 kg de grăsime.

36 25 2 Material și metode Diametrul foliculului și înălțimile epiteliale au fost apoi măsurate pe imagini digitalizate care au fost înregistrate cu o cameră video color Sony 3CCD pe Axioscop la mărire 200x (Zeiss, Jena, Germania). 30 de diametre ale foliculului și înălțimea a trei celule epiteliale asociate au fost măsurate pe lamă (Seffner și Heller, 1979; Seffner, 1982). Evaluarea a fost efectuată utilizând programul de evaluare KS (Zeiss, Jena, Germania). Tabelul 14: Schema de încorporare în mașina de încorporat Etape de încorporare Timp de încorporare (ore) 1 Etanol 70% I 1 2 Etanol 70% II 1 3 Etanol 80% 1 4 Etanol 90% 1 5 Etanol 96% I 1 6 Etanol 96% II 1 7 Etanol abs. I 1 8 etanol abs. II 1 9 Xilen I 1 10 Xilen II 1 11 Parafină I 2 12 Parafină II Cel puțin 1 Tabel 15: Îndepărtarea agentului de încorporare Etapa de îndepărtare Durata îndepărtării (min) 1. Xilen II Îndepărtarea parafinei 5 2. Xilenul II Îndepărtarea xilenului care conține parafină 5 3. Xilen III Îndepărtarea ultimelor urme de parafină 5 4. Xilen: Etanol abs. 1: 1 (v/v) îndepărtarea xilenului 1 5. Etanol abs. I Îndepărtarea xilenului 5 6. Etanol abs. II Eliminarea reziduurilor de xilen 5 7. Etanol abs. III Eliminarea reziduurilor de xilen 5 8. Etanol 96% 1 9. Etanol 80% apă (deionizată) Schimbare de mai multe ori 5

40 29 2 Materiale și metode Peroxidază tiroidiană Parametrii reacției sunt prezentați în Tabelul 18. Tabelul 18: Parametrii RT-PCR pentru peroxidaza tiroidiană mrna și secvențe de perechi de primer TPO (EMBL ID: RNTPO) Primer 1 5 CCA CAA AAG GCC GAG GTT CAA G 3 Primer 2 5 AAG GGC TGT GGC ATT TAT TCG TCT 3 Concentrația primerului sinteza cdna To Go TM Bile RT-PCR, Amersham Pharmacia) GAPDH (EBMI ID: RNGAPDHR) Primer 1 5 GCA TGG CCT TCC GTG TTC C 3 Primer 2 5 GGG TGG TCC AGG GTT TCT TAC TC 3 TPO - 1,0 pmol/µl amestec de perechi de grund GAPDH - 1,0 pmol/µl amestec de perechi de grund 34 µl apă ultrapură fără ARN 1 µl Oligo pd (T) (12-18) (0,5 µg/µl) 5 µl probă de ARN (0,2 µg/µl) iar cdna a fost sintetizată în 25 minute la 42 ° C. Apoi ADN-ul a fost denaturat la 95 ° C timp de 4,5 minute. Reacție PCR (Pharmacia) (Redy To Go TM RT-PCR Beads, Amersham Pharmacia) 40 µl amestec de reacție denaturat (sinteză cdna) 5 µl TPO amestec de perechi de primeri 5 µl GAPDH amestec de perechi de primari Loturile au fost amestecate și efectuate timp de 42 de cicluri (95 C, 30 sec. Denaturare; 60 ° C., 30 sec. Fixare amorsă; 72 ° C., 45 sec. Amplificare amorsă) efectuată. Abrevieri: GAPDH, gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază; TPO, peroxidaza tiroidiană; ID EMBL, numărul de identitate al secvenței mrna la Laboratorul European de Biologie Moleculară.

43 32 2 Material și metode Parametrii sistemului de protecție antioxidantă Concentrația de α-tocoferol în plasmă și ficat a fost determinată ca parametru al sistemului de protecție antioxidantă. Timpul de întârziere a fost determinat ca un parametru al sensibilității la oxidare a LDL. În plus, s-a determinat activitatea GSH-Px care conține seleniu în citosolul hepatic și activitatea superoxidului dismutazei (SOD) în eritrocite Determinarea concentrației de α-tocoferol în plasmă și ficat Presupunând 0,05 g de ficat și 200 µl de plasmă, concentrația de α- tocoferoli conform metodei lui Balz și colab. (1993) și Coors (1991) determinate (vezi capitolul 2.3.2) Sensibilitatea la oxidare a lipoproteinelor cu densitate scăzută Sensibilitatea la oxidare a LDL a fost determinată ca timp de întârziere pe baza metodei Esterbauer și colab. (1989) determinat. Timpul de întârziere este definit ca intervalul (min) dintre punctul de pornire al măsurării și intersecția liniei drepte (a) a absorbției inițiale și a tangentei (b) la regiunea creșterii liniare a curbei de absorbție (Kleinveld, și colab., 1992) ( Figura 2). 1,0 Absorbanță la 234 nm 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Timp de întârziere [min] Figura 2: Determinarea timpului de întârziere conform Kleinveld și colab. (1992)

49 38 2 A fost început materialul și metodele. Toate mediile de testare au fost încălzite la o temperatură de 25 C înainte de determinare și creșterea extincției a fost apoi măsurată la 339 nm și 25 C timp de 1 min pe un spectrometru (Pharmacia Biotech, Freiburg, Germania). Valoarea necompletată a fost utilizată pentru a corecta valorile eșantionului; formarea nespecifică a NADPH/H + a fost determinată fără adăugarea de malonil-CoA și scăzută din valoarea eșantionului. Activitatea FsS a fost calculată utilizând ecuația descrisă în capitolul Determinarea concentrației relative de mrna a enzimelor lipogene din ficat. ARN-ul total a fost determinat folosind metoda tiocianatului de guanidiniu de Chirgwin și colab. (1979) modificat după Chomaczynski și Sacchi (1987) cu reactiv RNAzol B (WAK Chemie Medical, Bad Soden, Germania), izolat. Primerii G6PDH, FsS și GAPDH au fost determinați pe baza metodei lui Köhler (1995) și au fost efectuate studiile cinetice (vezi capitolul).