Dublă injecție directă de sânge în Cisterna Magna ca model de hemoragie subarahnoidiană

rezumat

În acest protocol am descris un model standardizat de hemoragie subarahnoidiană (SAH) printr-o dublă injecție de sânge integral autolog în cisterna magna. Gradul ridicat de standardizare a procesului de dublă injecție reprezintă un model mediu până la acut al SAH cu certitudine relativă a mortalității.

sânge

Abstract

Introducere

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Toate procedurile au fost efectuate sub supravegherea lui H. Castel, în conformitate cu Comitetul de etică francez și cu orientările Directivei 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului pentru protecția animalelor utilizate în scopuri științifice. Acest proiect a fost aprobat de CENOMEXA local și de comitetele naționale de etică pentru cercetarea și testarea animalelor. Șoarecii masculi C57Bl/6J Rj (Janvier) în vârstă de 8-12 săptămâni au fost adăpostiți în condiții de mediu controlate standard: 22 ° C la 1 ° C, ciclu lumină/întuneric de 12 ore/12 ore și apă și alimente ad libitum.

1. Instalați o intervenție chirurgicală SAH și pregătiți-vă pentru injecție

Al doilea animal (șoareci masculi C57BL/6J de 8-10 săptămâni) preparat

3. Inducția SAH

4. Urmărirea postoperatorie și sfârșitul experimentului

  1. Imediat după operație, se izolează și se poziționează șoarecele ulcer decubit cu o pătură de supraviețuire pe spate într-o cutie deschisă în timp ce se recuperează.
  2. Cântărește și observă comportamentul fiecărui șoarece până la victimă zilnic (de exemplu, D7 postoperator).
  3. O pierdere semnificativă în greutate (> 15% din greutate) este notată clasic printre obiectivele umane. O „postură înapoi îndoită”, mișcări lente, prostrație, formarea vocală anormală din cauza leziunilor și/sau comportament agresiv semnificativ sunt, de asemenea, semne importante ale suferinței animalelor. Dacă apare oricare dintre aceste semne sau o combinație de semne, monitorizarea animalului va fi crescută în câteva ore de la apariția lor. Dacă bunăstarea animalului se deteriorează sau nu se îmbunătățește în 48 de ore, se consideră că se ajunge la o suferință insuportabilă și se realizează eutanasierea.
  4. În momentul alegerilor, sacrificați șoarecii anesteziați prin decapitare și recoltați creierele pentru o analiză ulterioară.
  5. Eutanasie (decapitare) după anestezie cu izofluran (5%).

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

Vasospasm cerebral SAH
Așa cum El Amki și colab. 22 prezintă artera bazilară (BA), artera cerebrală medie (MCA) și artera cerebrală anterioară (ACA) CVS a fost prezentă în modelul SAH prin injecție dublă intracisternală de sânge în ACA, MCA sau BA de la D3 la D10 post-chirurgie. Pe scurt (Figura 2A), după sacrificarea și decapitarea șoarecilor, creierele au fost recoltate și postfixate în paraformaldehidă 4% (PFA) și apoi congelate la -80 ° C. înainte de a fi tăiate în felii transversale de 20 m cu un criostat. Colorarea hematoxilinei și eozinei a fost utilizată pentru BA (interaural e0,40 mm; Bregma -3,40 mm), MCA (interaural 2,58 mm; Bregma -1,22 mm) și ACA (interaural e4,90 mm; Bregma 1,10 mm) pentru a permite identificarea CVS prin înregistrarea sistematică a imaginilor de geamuri colorate folosind o cameră microscopică. Pentru a evalua absența sau prezența CVS macroscopic, raportul dintre aria lumenului și grosimea peretelui a fost calculat pentru fiecare arteră colorată. Cu cât raportul este mai mic, cu atât CVS este mai greu. De exemplu, CVS a apărut în BA în creierele SAH în comparație cu creierele de șoarece fals (Figura 2B), dar și în alte artere cerebrale mari (MCA, ACA, date neprezentate 22).

Discuţie

În acest context, modelul este similar cu fiziopatologia clinică SAH pentru CVS asociat SAH. În general, CVS apare în modelul de perforație endovasculară la MCA și BA după 1 oră la șobolani 40 și după 3 zile la șoareci 17. În modelul de cisternă preechiasmatică de injectare a sângelui, incidența CVS a fost prezentată între două zile 49 și opt zile 37 la șobolani. În modelul cu injecție dublă în cisterna magna la șobolani, CVS s-a dezvoltat între 10 minute 29 și 3 zile 31. Suntem primii care descriu aspectul cinetic al CVS într-un model de șoarece de SAH prin injecție dublă, stabilim CVS în arterele cerebrale majore (ACA, MCA și BA) timp de 3 zile și persistăm până în a 10-a zi după SAH 22, aproape de aceea ceea ce se observă la pacienții cu SAH. Acest ultim model ar putea fi definit ca un model calificat al SAH, suficient de riguros, fără mortalitate, pentru a permite studiul mecanismelor și terapeutice care vizează CVS.

Un alt parametru necontrolat în modelul SAH a fost posibilele variații ale tensiunii arteriale medii (MABP) induse de o procedură de injectare a sângelui excesiv de rapidă 27. De fapt, MABP crește de obicei acut după SAH experimental pentru a menține presiunea de perfuzie cerebrală și apoi cade la valoarea inițială. În modelul SAH, am injectat sânge sau CSC (aprox. 10 l/min) la o rată scăzută pentru a evita aceste variații MABP. În ceea ce privește evenimentele neurobiologice din acest model care imită cele observate la oameni, am arătat anterior că modelul cu injecție dublă de sânge a SAH induce CVS de durată, microtromboză și leziuni cerebrale dăunătoare creierului, inclusiv difuzie paravasculară defectă din ziua 3 până în ziua 10 după a văzut 22. Cu toate acestea, date recente care descriu că CSD este implicat în DCI 13 asociat SAH susțin cu tărie urmărirea acestui tip de studiu în modelul cu injecție dublă a șoarecilor. Acest lucru ar trebui să permită descoperiri științifice cu privire la efectele pozitive ale noilor terapii care vizează CSD.

În concluzie, aș dori să spun că injecția dublă de sânge arterial integral în modelul cisternei magna este un model stăpânit care oferă o modalitate ușoară de a imita fiziopatologia SAH umană, inclusiv CVS, microtromboză, inflamație vasculară, deficite neurologice și rata mortalității. Reprezintă un model validat pentru testarea unor noi abordări terapeutice pentru tratamentul mortalității morbide asociate cu SAH.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.