Efect bactericid al substanței vegetale secundare izotiocianat - GRIN
Lucrări tehnice (școală), 2012
36 pagini, nota: 1.0
Johannes Rößler (Autor)
Cuprins
2. Fundamente teoretice
2.1 Apariția naturală a glucozidelor
2.2 Importanța izotiocianatului pentru plantă
2.3 Principii chimice
2.3.1 Glucozide
2.3.2 Sinigrin
2.3.3 Izotiocianat
2.4 Conversia enzimatică
2.5 Obiectivul lucrării seminarului
3. Implementarea și explicația experimentală
3.1 Instrucțiuni de testare utilizate
3.2 Extracții
3.2.1 Extracția sinigrinei
3.2.2 Extracția mirozinazei
3.3 Hidroliza enzimatică a extractului glucozidic în izotiocianat
3.4 cromatografii în strat subțire
3.4.1 Explicația metodei de cromatografie în strat subțire
3.4.2 Efectuarea cromatografiei Sinigrin Thin Layer
3.4.3 Efectuarea cromatografiei în strat subțire pe izotiocianat
3.4.4 Efectuarea cromatografiei în strat subțire pe izotiocianat și sinigrină
3.5 test enzimatic
3.5.1 Efectuarea testului enzimatic
3.5.2 Efectuarea cromatografiei în strat subțire a testului enzimatic
3.5.3 Explicația testului enzimatic
3.6 Metode de detectare a bacteriilor
3.6.1 Test de inhibiție pentru a demonstra efectul antibacterian al izotiocianatului
3.6.2 Bioautografie
4. Rezultate
4.1 Rezultatele cromatografiei în strat subțire
4.1.1 Rezultatele cromatografiei în strat subțire Sinigrin
4.1.2 Rezultatele cromatografiei în strat subțire a izotiocianatului
4.1.3 Rezultatele cromatografiei în strat subțire a izotiocianatului și sinigrinei
4.1.4 Rezultatele cromatografiei în strat subțire ale testului enzimatic
4.1.5 Valorile RF pentru a reprezenta distanța relativă de rulare în DC
4.2 Rezultatele metodelor de detectare antibacteriană
4.2.1 Rezultatul testului de inhibare
4.2.2 Rezultatul bioautografiei
7. Anexă
7.1 Lista abrevierilor
7.2 Tabelele
1. Introducere
2. Fundamente teoretice
2.1 Apariția naturală a glucozidelor
Glucozidele se formează din aminoacizi din metabolismul secundar al plantelor (Watzl, 2001). Aminoacizii sunt descompuși într-o aldoximă, care este decarboxilată în acid fenilacetic și apoi într-un glucozid (Kindl, 1975). Glucozidele apar în mod natural numai la plantele din genul superior (Dörnemann, 2008), de ex. în familia cruciferelor (Brassicaceae, sinonim. Cruciferae; Ahlheim, 1983) ca cel mai important reprezentant al genului (Luciano, 2009). Cu toate acestea, glucozidele pot fi găsite și în capere (Capparidaceae), nasturții (Tropaeolaceae) și plante Reseda (Rescedaceae) (Dörnemann, 2008). În prezent sunt cunoscute în jur de 130 de glucozide diferite (Wittstock, 2004). Conținutul de substanță uscată al glucozidelor poate fi de până la 1% la unele specii de Brassica (Watzl, 2001), dar cantitatea de glucozide în formă sălbatică poate depăși cantitatea conținută într-o plantă cultivată de 1000 de ori (Watzl, 2001).
Glucozidele din ulei de muștar se găsesc în plantele de muștar (Sinapis), care aparțin și familiei cruciferelor (Ahlheim, 1983; Dörnemann, 2008). Cu toate acestea, diferite tipuri de muștar formează un amestec de glucozide diferite din ulei de muștar (Lara-Lledó, 2012). De exemplu, muștarul alb (Sinapis alba) produce în principal sinapină, în timp ce muștarul negru (Brassica nigra) și muștarul oriental (Brassica juncea) produc în principal sinigrină (Lara-Lledó, 2012). În general, apariția unui miros înțepător după ce țesutul celular al plantei a fost distrus poate indica prezența glucozidelor din ulei de muștar (Dörnemann, 2008). Acest miros înțepător este cauzat de uleiurile de muștar (izotiocianați), acestea rezultând din defalcarea enzimatică a glucozidului din ulei de muștar.
Enzima care hidrolizează glucozidul din ulei de muștar se numește mirozinază sau β-tioglucozidază (Lara-Lledó, 2012; Luciano, 2009; Watzl, 2001; Dörnemann, 2008). Apare la toate plantele care produc uleiuri de muștar.
2.2 Importanța izotiocianatului pentru plantă
Produsele degradării enzimatice a glucozidelor din ulei de muștar oferă plantei substanțe de apărare extrem de eficiente împotriva prădătorilor (erbivore) și a microorganismelor patogene ale plantelor (Wittstock, 2004; Aires, 2009). Aceste produse sunt diferiți izotiocianați (ITC), tiocianați și nitrili, care sunt extrem de toxici pentru organismele microbiologice (Lara-Lledó, 2012; Watzl, 2001; Wittstock, 2004; Luciano, 2009). Izotiocianatul singur are un efect bactericid, fungicid, erbicid și toxic împotriva țesutului animal (Aires, 2009; Luciano, 2009; Lara-Lledó, 2012; Hock, 1984).
Această formă de auto-protecție a plantelor este cunoscută sub numele de apărare constitutivă, deoarece etapa preliminară a agentului de apărare s-a format în celulă înainte ca aceasta să intre în contact cu erbivorele sau agentul patogen. Cu toate acestea, toxina vegetală este produsă numai atunci când structura celulară este rănită direct. Acest proces este adesea denumit „bombă” din ulei de muștar vegetal, deoarece „se declanșează” doar atunci când cele două componente intră în contact direct (Wittstock, 2004).
În planta de muștar sau semințele de muștar, uleiul de muștar glucozid și mirozinaza sunt separate spațial unele de altele. Substratul enzimatic (glucozid din ulei de muștar) este situat în compartimente (vacuole) lângă peretele celular (Rausch, 1999), în timp ce enzima (mirozinaza) este distribuită în așa-numiții indoblasti (celule specializate/„ciudați” ai structurii celulare) (Sitte, 1998) . Enzima și substratul acesteia vin în contact prin acțiune mecanică, după care începe reacția și toxina de apărare își desfășoară efectul (Dörnemann, 2008; Lara-Lledó, 2012; Watzl, 2001). Cu toate acestea, alte genuri de plante care conțin glucozide depozitează substratul și enzima în moduri diferite. Cresa thalelor (Arabidopsis thaliana), de exemplu, formează așa-numitele celule S care conțin glucozide în apropierea sitei, precum și propriile sale celule de mirozinază pe scoarță (Wittstock, 2004).
2.3 Bazele chimice
2.3.1 Glucozide
Glucozidele (glucozinolații) (Figura 1) sunt biomolecule ionice stabile din punct de vedere chimic, nevolatile, care aparțin grupului de metaboliți care conțin sulf. Acestea constau dintr-o unitate de glucoză pe o grupare care conține sulf-azot, o grupare sulfat și un reziduu variabil. Structura este astfel o combinație dintr-un reziduu de tioglucoză pe un ester N-hidroximinosulfat și reziduul de agluconă (R, vezi mai jos). Acest radical poate consta dintr-o grupare alchil, alchenil, arii sau indolil. Determină efectul fiziologic (Watzl, 2001; Wittstock, 2004). Există un cation pe grupul sulfat, de obicei K + (Dörnemann, 2008).
Figura nu este inclusă în acest extract
Figura 1: Structura generală a unui glucozid din ulei de muștar
Nomenclatura pentru glucozide este diferită, așa că atunci când se formează numele comun, numele plantei este precedat de „Gluco” și se adaugă terminația „in”. De exemplu, glucozidul de creștet (Nasturtium officinale) este cunoscut sub numele de „Gluco-nasturti-in” (Dörnemann, 2008). Cu toate acestea, denumirea sistematică este mai precisă, așa cum arată Figura 2.
Figura nu este inclusă în acest extract
Figura 2: Exemplu de nomenclatură năsturel
2.3.2 Sinigrin
Denumirea sistematică a sinigrinei este alil glucozinolat, substanța chimică este 1- (N- (sulfoxi)-
3-butenimidat-1-tio-β-D-glucopiranoză. Formula sumei empirice este:
[C10H16NO9S2] -K +. Greutatea moleculară este de 397,46 g/mol (Sigma-Aldrich). Figura 3 prezintă structura sinigrinei.
Figura 3: Structura moleculară a sinigrinei
Figura nu este inclusă în acest extract
2.3.3 Izotiocianat
Izotiocianații sunt rezumați sub termenul „uleiuri de muștar”. Isotiocianații sunt molecule volatile și instabile din punct de vedere chimic dacă sunt formate din indozil glucozinolați. Se descompun spontan în indol-3-carbinol și alți compuși indolici (Watzl, 2001). Acestea apar din descompunerea enzimatică a unui glucozid din ulei de muștar și au un efect toxic. Structura de bază este următoarea (Figura 4):
Figura nu este inclusă în acest extract
Figura 4: Structura moleculară generală a ITC
Când se transformă alil glucozinolatul, se formează aloti izotiocianat (AITC) (Aires, 2009). Formula empirică pentru aceasta este C4H5NS (formula structurală vezi Figura 5). Masa moleculară este de 99,15 g/mol (Sigma-Aldrich).
Figura nu este inclusă în acest extract
Figura 5: Structura moleculară a AITC
2.4 Conversia enzimatică
Hidroliza glucozidului din ulei de muștar în ulei de muștar este catalizată de mirozinază, prin care legătura sulf-glucoză a substratului (ulei de muștar glucozid) este hidrolizată (Wittstock, 2004). Se formează cantități echimolare de β-D-glucoză, sulfat și agluconă specifică glucozidei. Acidul ascorbic acționează aici ca o coenzimă, deoarece poate furniza o grupare catalitică nucleofilă. Aglucona instabilă reacționează în continuare la produsul primar, izotiocianatul, în funcție de valoarea și temperatura pH-ului (Wittstock, 2004). Se formează, de asemenea, produse secundare, cum ar fi tiocianații, nitrilii și epitionitrilii (Lara-Lledó, 2012). Izotiocianații se formează în principal la o valoare neutră a pH-ului, în timp ce nitrilii se formează la o valoare acidă a pH-ului (Wittstock, 2004). Figura 6 prezintă o prezentare generală a procesului de conversie enzimatică.
Figura nu este inclusă în acest extract
Figura 6: Mecanism și produse ale conversiei enzimatice a glucozidelor
2.5 Obiectivul lucrării seminarului
Scopul acestei lucrări este extragerea uleiului de muștar glucozid sinigrin și enzima mirozinază din semințele de muștar. Enzima ar trebui să hidrolizeze glucozidul în izotiocianat (ITC). Mai mult, efectul antibacterian al produsului de reacție enzimatică ar trebui confirmat și ITC ar trebui identificat în amestecul de substanțe al reacției.
Scopul acestei lucrări a fost de a determina pentru prima dată dacă o versiune simplificată a metodei bioautografice (Reusser, 1967) este adecvată pentru separarea izotiocianatului de amestecul de reacție al procesului de extracție (cromatografie în strat subțire) și identificarea acestuia datorită efectului său toxic asupra bacteriilor.
Testele au fost efectuate cu semințe de Brassica juncea, deoarece, potrivit companiei Develey GmbH, acestea conțin mai mult ulei de muștar glucozid decât semințele de Sinapis alba descrise în instrucțiunile de testare (Dörnemann, 2008).
3. Implementarea și explicația experimentală
3.1 Instrucțiuni de testare utilizate
Instrucțiunile de testare pentru extracția mirozinazei și sinigrinei, protocolul pentru conversia enzimatică și implementarea cromatografiei în strat subțire (TLC), sunt în cea mai mare parte instrucțiunile cursului: "Ingrediente vegetale secundare" de PD Dr. Dieter Dörnemann, Universitatea Philipps Marburg din departamentul de biologie (fiziologia plantelor/fotobiologia) preluat din (Dörnemann, 2008).
Cu toate acestea, subprocedurile individuale au fost modificate independent. Muștarul soiului Brassica juncea a fost folosit pentru extragerea sinigrinei și mirozinazei, deoarece acest soi are cel mai mare conținut de sinigrină și, astfel, conform literaturii, arată cel mai puternic efect antibacterian (Lara-Lledó, 2012).
Instrucțiunile pentru testul de inhibare bacteriană au fost preluate din cartea „Mikrobiologisches Praktikum” (Drews, 1983). Metoda bioautografiei a fost modificată din: „O metodă pentru bioautografia cromatogramelor în strat subțire” (Reusser, 1967).
3.2 Extracții
3.2.1 Extracția sinigrinei
Procesul de purificare a sinigrinei a început prin măcinarea a 10 g de semințe de muștar într-un mortar cu adăugarea a 30 ml de etanol 80% (aq.). Acest lucru a distrus structura celulelor și a eliberat glucozidul. Alcoolul a împiedicat conversia enzimatică a sinigrinei de către mirozinază. Masa omogenă a fost apoi transferată într-un balon cu un singur gât și completată până la 100 ml cu 80% etanol (apos). Produsul a fost apoi fiert timp de 60 de minute folosind un condensator de reflux (Figura 7), încălzirea într-o baie de apă și punctul de fierbere fiind de aproximativ 85 ° C datorită amestecului etanol/apă.
Figura nu este inclusă în acest extract
Figura 7: Extracția sinigrinei din Figura 8: Balonul de
Baie de apă cu condensator de reflux 1. Extracție sinigrină
Ca rezultat, sinigrina a fost legată în faza etanol-apă a amestecului. Supernatantul apos rezultat din etanol a fost apoi îndepărtat (prima extracție, Figura 8). Folosind această metodă, reziduul a fost din nou amestecat cu 50 ml etanol 80% (apos) și de data aceasta a fiert doar 30 de minute folosind un condensator de reflux. Această a doua extracție ar trebui să crească randamentul sinigrinei. Supernatanții din cele două extracții au fost combinate și centrifugate pentru a separa solidele complet și supernatantul a fost îndepărtat din nou pentru procesare ulterioară. Într-un evaporator rotativ (Figurile 9 și 10), tot etanolul a fost apoi îndepărtat sub vid și sinigrina a fost concentrată în faza apoasă (Figura 11).
Figura nu este inclusă în acest extract
Figura 10: Înainte de concentrare
Figura nu este inclusă în acest extract
Figura 9: Evaporator rotativ Figura 11: După concentrare
Acesta a fost urmat de completarea a 10 ml cu H2O (dd), cu un precipitat puternic alb-gălbui. Apoi s-a făcut până la 30 ml cu H2O (dd.). Apoi a fost extras de mai multe ori cu dietil eter, ca urmare a cărui componente hidrofobe (de exemplu, lipide celulare) au trecut în faza eterică și au fost îndepărtate din extract prin ridicarea și reutilizarea fazei inferioare. Precipitatul alb menționat mai sus ar putea fi îndepărtat prin extracția cu eter. Faza apoasă conținând sinigrină a fost apoi concentrată la 5 ml într-un evaporator rotativ pentru a concentra sinigrina. Un efect secundar al evaporării este îndepărtarea completă a dietil eterului rămas. Preparatul obținut a fost împărțit în alicote de 4 × 200 μl și congelat la -20 ° C. sau supus cromatografiei în strat subțire și o conversie enzimatică.
3.2.2 Extracția mirozinazei
Pentru a inhiba proteazele celulare care ar putea descompune enzima care urmează să fie extrasă mirozinază, toate etapele de purificare au fost efectuate într-un mod răcit, astfel încât mortarul, pistilul și tacâmurile au fost răcite cu N2 (lichid) înainte de experiment. Acum, 20 g de semințe de muștar (Figura 12) au fost măcinate, eliberând enzima din celule.
Figura nu este inclusă în acest extract
Figura 12: Freză Figura 13: Decantare Figura 14: Tub de dializă
3.3 Hidroliza enzimatică a extractului glucozidic în izotiocianat
Titlu Efect bactericid al substanței vegetale secundare izotiocianat (ulei de muștar) Grad 1.0 Autor Johannes Rößler (Autor) An 2012 Pagini 36 Număr de catalog V300661 ISBN (eBook) 9783656966845 ISBN (carte) 9783656966852 Dimensiune fișier 1824 KB Limbă germană Note Premiul 1 al celei de-a 10-a conferințe a studenților Universitatea din München, cooperare cu Helmholtz Zentrum München, susținută de Develey GmbH. Cuvinte cheie Gymnasium Grafing, Technical University Munich, Helmholtz Zentrum München, TUM student conference, mustar, ulei de muștar glucozid, izotiocianat, bioautografie, mirozinază, efect bactericid, Sinapis juncea, cromatografie în strat subțire, test de inhibare bacteriană, chimie, biochimie, hârtie pentru seminar Preț (carte) 14,99 € (carte electronică) 12,99 € lucrare citând Johannes Rößler (autor), 2012, efect bactericid al substanței vegetale secundare izotiocianat (ulei de muștar), München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/300661
- Niciun comentariu încă.