Exprimarea inhibitorului celular al apoptozei proteine-2 la subcutanat și

  • abstract
  • introducere
  • Metode
  • Subiecte și eșantionare
  • Prepararea ARN și RT-PCR
  • Izolarea proteinelor și analiza Western Blot
  • Detectarea apoptozei
  • analize statistice
  • Rezultate
  • discuţie
  • mulțumire

abstract

ŢINTĂ: În prezent În acest studiu, am abordat întrebarea dacă există expresie specifică depozitului inhibitorului celular al apoptozei proteine-2 (cIAP2) deja în copilărie și dacă expresia relativă se modifică odată cu creșterea vârstei, cu un risc crescut de obezitate viscerală.

Subiecte: 23 de pacienți (12 copii și 11 adulți) primit probe pereche de țesut adipos uman (OM) și țesut adipos subcutanat (SC).

METODĂ: Nivelurile de ARNm de cIAP2 au fost determinate folosind reacția în lanț a transcripției reversibile a polimerazei (RT-PCR) și expresia proteinelor confirmată prin Western blot. Indicii apoptozei au fost determinați prin marcarea terminală a fluoxiceinelor cu fluoroxidină dUTP mediată de deoxinucleotidiltransferază (TUNEL).

REZULTATE : ARNm cIAP2 a fost de 1,51 ori mai mare în OM decât în ​​țesutul adipos SC (OM> SC la 20 din 23 subiecți; P SC la nouă din 10 subiecți, P 1

Obezitatea se caracterizează printr-o creștere a masei țesutului adipos. Masa de grăsime corporală, în special acumularea de grăsime viscerală, este strâns legată de rezistența la insulină, bolile cardiovasculare, hipertensiunea arterială și alte tulburări metabolice grave. 2 Acest lucru a arătat importanța identificării factorilor genetici care reglementează nu numai masa grasă, ci și distribuția grăsimilor.

Se știe că adipocitele omentale (OM) și subcutanate (SC) diferă prin diferite proprietăți metabolice care reglează volumul celulelor grase. 3, 4 Replicarea, diferențierea și răspunsul apoptotic al celulelor adipoase umane par a fi influențate de regiunea anatomică. 5, 6. Distribuția țesutului adipos ar putea fi, prin urmare, atribuită diferențelor specifice locului în reglarea acestor procese. Recent s-a demonstrat că caracteristicile regionale pot fi legate de diferențele specifice site-ului în expresia genelor care codifică proteine ​​funcționale importante. 7 De exemplu, leptina și expresia PPAR γ sunt mai mari în SC decât în ​​țesutul adipos OM. 8, 9 În schimb, expresia receptorului de insulină (Ex. 11-) este mai mare în OM decât în ​​țesutul adipos SC. 9

Inhibitorul proteinei-2 a apoptozei celulare (cIAP2) aparține familiei de proteine ​​a apoptozei (IAP), care este implicată în reglarea apoptozei în timpul proliferării și diferențierii celulare. 10, 11, 12 Rolul IAP în țesutul adipos uman nu este clar, dar un număr tot mai mare de dovezi sugerează că acestea pot juca un rol în reglarea distribuției grăsimii corporale prin modularea apoptozei celulelor grase. Un raport a arătat că expresia dependentă de diferențiere a proteinei inhibitoare a apoptozei neuronale (NAIP) în adipocitele 3T3-L1 se poate corela cu dezvoltarea rezistenței adipocitelor la apoptoză. Alte două studii au raportat că ARNm cIAP2 este exprimat în mod specific în depozit în celulele adipoase umane adulte. 14, 15

Până în prezent, cercetările privind diferențele în expresia genelor s-au concentrat asupra adulților. Se cunosc foarte puține lucruri despre expresia genelor specifice locului în țesutul adipos la copii. Deoarece există diferențe dependente de vârstă în ceea ce privește masa și distribuția în țesutul adipos uman, ne-am ocupat de întrebarea dacă există o expresie specifică a depozitului de cIAP2 încă din copilărie și, dacă da, dacă expresia relativă se schimbă odată cu creșterea vârstei și dacă există un risc de risc visceral. Obezitatea. În studiul actual, am comparat, prin urmare, nivelurile de expresie ale cIAP2 atât la nivelul ARNm, cât și la nivelul proteinei în țesutul adipos OM și SC al copiilor și adulților. În plus, am examinat relația dintre nivelul expresiei cIAP2 și rata apoptozei adipocite, indicele de masă corporală (IMC) și sexul.

Metode

Subiecte și eșantionare

Prepararea ARN și RT-PCR

Nivelurile de ARNm de cIAP2 au fost determinate la toți subiecții la care ARN-ul total era disponibil atât din țesutul adipos SC, cât și din OM. ARN-ul total a fost preparat folosind reactivul TRIzol (Invitrogen Life Technologies, CA, SUA) conform protocolului producătorului. ARN-ul a fost cuantificat spectrofotometric. Integritatea ARN-ului a fost verificată prin colorarea cu bromură de etidiu a benzilor de ARN ribozomale folosind un gel de agaroză 1%. ARN-ul obținut a fost depozitat la -70 ° C până la utilizare.

RT-PCR a fost efectuat pentru a analiza mRNA cIAP2. ARN total (0,5 × 1 μg) a fost extras timp de 1 oră la 42 ° C. într-un tampon de 20 μl care conține 200 U MMLV revers transcriptază, 0,5 μg oligo d (T) 16, 0,5 mmol/l dNTP, Inhibitor de 20 U RNază, transcris invers. Probele de ADN complementar (ADNc) au fost denaturate timp de 5 minute la 95 ° C. și 5 μl de ADNc din fiecare probă au fost utilizate pentru amplificarea PCR ulterioară într-un volum final de 50 μl de tampon conținând 2,5 U Taq ADN polimerază, 0, 2 mmol/L, conținea dNTP, 2,5 mmol/L MgCl2 și 0,4 μmol/L din fiecare primer. Condițiile PCR au fost de 95 ° C timp de 5 minute, urmate de 30 de cicluri de 94 ° C timp de 30 de secunde, 60 ° C timp de 45 de secunde și 72 ° C timp de 1 minut și în cele din urmă extindere de 72 ° C pentru încă 10 minute. Reactivii pentru RT au fost furnizați de Promega Corp. (Madison, SUA). Reactivii pentru PCR au fost de la Roche (Mannheim, Germania). În acest RT-PCR semicantitativ, au fost utilizate simultan două seturi de grund (Tabelul 1). S-au folosit diferite numere de cicluri PCR pentru a se asigura că amplificarea atât a cIAP2, cât și a ADNc-β-actinei a fost în intervalul exponențial. Primerii pentru β-actină au fost adăugați în al șaselea ciclu al fiecărei amplificări PCR.

După amplificare, 10 .mu. l din amestec separat pe un gel de agaroză 1,5% colorat cu bromură de etidiu. Gelurile au fost vizualizate sub lumină UV, densitatea și raportul dintre cIAP2 și β-actină au fost măsurate și analizate folosind software-ul de cuantificare, versiunea 4 Windows și Macintosh (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, SUA).

Izolarea proteinelor și analiza Western Blot

Detectarea apoptozei

Adipocitele apoptotice din 15 probe împerecheate au fost detectate prin marcarea terminală a deoxinucleotidil transferazei mediată prin DUTP-fluoresceină nick-end (TUNEL) conform protocolului producătorului. Indicii apoptotici au fost obținuți numărând 200 de adipocite în cel puțin patru câmpuri vizuale la microscopul cu lumină.

analize statistice

Datele au fost analizate folosind pachetul statistic pentru științe sociale (SPSS), iar valoarea P mai mică de 0,05 a atribuit o semnificație. Deoarece expresia cIAP2 nu a fost distribuită în mod normal în țesutul adipos, este prezentată în text și tabel ca o mediană (interval intercuartil). Testul de rang semnat Wilcoxon a fost utilizat pentru a compara diferențele de expresie dintre SC și OM; Testul Mann-Whitney a fost utilizat pentru a compara diferențele specifice depozitelor între copii și adulți. Corelațiile au fost calculate utilizând testul coeficientului de corelație Spearman.

Rezultate

Comparațiile în perechi ale expresiei ARNm cIAP2 din țesutul adipos SC și OM au fost cuantificate prin RT-PCR, așa cum se arată în Figura 1a. A existat o variație notabilă a nivelului de exprimare între indivizi, în special în OM (1b). Cu toate acestea, a existat o diferență semnificativă specifică depozitului în nivelul de expresie al ARNm cIAP2 (Tabelul 2). ARNm cIAP2 a fost de 1,51 ori mai mare în OM decât în ​​țesutul adipos SC (OM> SC la 20 din 23 de subiecți; P.

inhibitorului

Diferențe specifice depozitului în expresia ARNm a cIAP2. (a) Exemplu de analiză a gelului de agaroză după RT-PCR a probelor pereche de țesut adipos SC și OM de la cinci indivizi. (b) Scatterplots arată că expresia ARNm cIAP2 este prezentă în grăsimea SC și OM de la toți indivizii. Barele orizontale indică mediana.

Western blots sunt prezentate în FIG. În acord cu expresia ARNm, conținutul de proteină cIAP2 a fost mai mare în OM decât în ​​SC (OM> SC la nouă din 10 subiecți testați, P.

inhibitorului

Diferențe specifice depozitului în expresia proteinelor din cIAP2. (a) Exemplu de imunobloti de proteine ​​cIAP2 din țesutul adipos SC și OM de la patru indivizi. (b) Scatterplots arată expresia proteinei cIAP2 în grăsimi SC și OM de la 10 indivizi. Barele orizontale indică mediana.

Analiza imunohistochimică nu a arătat nicio diferență între SC și OM în indicii apoptotici ai adipocitelor (indici apoptotici 14 care au arătat o expresie a ARNm mai mare a cIAP2 în OM decât adipocitele SC ale adulților. Aceiași autori au arătat, de asemenea, că expresia ARNm cIAP2 în preadipocitele umane de OM este mai mare decât cea a grăsimii SC.15 Cu toate acestea, studiul lor s-a concentrat doar pe nivelurile de ARNm. Deoarece expresia ARNm nu reflectă întotdeauna expresia proteinelor sau concentrația de proteine ​​complet procesate, am extins observația prin adăugarea am confirmat că principala diferență între țesutul adipos OM și SC apare și la nivelul proteinelor.

CIAP2 a fost identificat inițial ca o proteină asociată cu complexul de semnalizare a receptorului TNF-a, sugerând că poate fi implicat în reglarea semnalizării TNF-a. 16 Supraexprimarea proteinei cIAP2 umane poate suprima moartea celulară declanșată de o varietate de stimuli. Comparativ cu adipocitele izolate umane, preadipocitele cultivate în mediu conținând ser au niveluri mai ridicate de ARNm cIAP2 și, de asemenea, o sensibilitate mai mică la apoptoza indusă de TNF-α. 14, 15, 17 Prin urmare, expresia cIAP2 în țesutul adipos SC și OM poate reflecta susceptibilitatea specifică depozitului la apoptoză și, prin urmare, poate provoca pierderea sau depunerea țesutului adipos.

În acest studiu nu am putut detecta nicio diferență în rata apoptozei bazale între adipocite din cele două depozite. O explicație probabilă este că indicii apoptotici bazali au fost prea mici pentru a fi cuantificați și comparați cu precizie. Această viziune este susținută de faptul că Prins și colab. 17 a arătat că indicele apoptotic bazal al celulelor adipoase cultivate în mediu conținând ser a fost foarte scăzut indiferent de metoda utilizată. Cu toate acestea, nu putem exclude faptul că metoda utilizată este prea insensibilă pentru a detecta o diferență a indicilor de apoptoză dintre cele două situri din țesutul adipos, care ar putea fi corelată cu diferența de expresie a cIAP2. În plus, rolul fiziologic al diferenței de expresie specifică site-ului în cIAP2 în țesutul adipos nu a fost încă investigat.

În rezumat, am comparat expresia ARNm cIAP2 în țesutul adipos SC și OM la 12 copii și 11 adulți. O expresie relativă mai mare în OM în comparație cu țesutul adipos SC a fost găsită la copii și adulți. Acest lucru sugerează că expresia diferită a cIAP2 între depozite se poate datora proprietăților inerente ale celulelor din cele două depozite. Diferența mai pronunțată specifică depozitului la copii poate reflecta un câștig net în țesutul adipos visceral în timpul creșterii.

mulțumire

Această lucrare a fost susținută de Fondul de Cercetare Științifică al Comitetului pentru Educație din Jiangsu (99KJD 320012) și Consiliul Suedez de Cercetare Medicală (19X-05708). Mulțumim domnului Xu Xiaoqun, domnului Lou Yao, domnului Chen Yijiang și prof. Peter Naredi pentru furnizarea de probe de țesut adipos pentru aceste studii și profesorului Tommy Olsson pentru discuții fructuoase.