Identificarea interactomului MyoD folosind purificarea tandemă a afinității cuplată cu spectrometria de masă

Abstract

Introducere

MyoD este considerat a fi principalul jucător în declanșarea diferențierii musculare terminale 9 deoarece are capacitatea de a induce programul de determinare/diferențiere miogenică (trans-diferențiere) în multe sisteme non-musculare complet diferențiate 10-13. Într-adevăr, expresia forțată a MyoD induce diferențierea trans a diferitelor tipuri de celule, chiar și a celor care provin dintr-o altă origine embriologică 12. De exemplu, MyoD poate converti hepatocitele, fibroblastele, melanocitele, neuroblastele și adipocitele în celule musculare similare. Acțiunea de trans-diferențiere a MyoD implică o activare anormală a programului genetic miogen (în special a genelor sale țintă) într-un mediu non-muscular, concomitent cu reducerea la zgomot a programului genetic original (în special, genele de proliferare).

În proliferarea mioblastelor, MyoD este exprimat, dar nu este capabil să-și activeze genele țintă, chiar și atunci când se leagă de promotorii lor 14-16. Prin urmare, cerința MyoD de a fi exprimată continuu în mioblaste nediferențiate rămâne destul de evazivă. MyoD a reușit să-și reprime genele țintă datorită recrutării enzimelor represive modificatoare ale cromatinei în proliferarea mioblastelor înainte de încărcare pentru a activa enzimele de remodelare a cromatinei 14,17. De exemplu, în proliferarea mioblastelor, MyoD este asociat cu co-represorul transcripțional KAP-1, histone deacetilaze (HDAC) și lizină care reprimă metiltransferazele (Kmts), inclusiv histona H3 lizină 9 sau H3K9 și H3K27 Kmts și suprimă activ expresia gene țintă prin stabilirea unei structuri de cromatină represive local 14,17. Important, un raport recent a indicat că MyoD în sine este metilat direct de H3K9 KMT G9a, rezultând inhibarea activității sale de transactivare 16.

Mecanismele epigenetice implicate în această trans-diferențiere a celulelor non-musculare de MyoD sunt în mare parte necunoscute. În special, anumite linii celulare sunt rezistente la diferențierea MyoD-trans indusă. Astfel, în celulele HeLa, MyoD este inactiv sau chiar poate funcționa mai degrabă ca un represor decât ca activator al transcrierii din cauza lipsei de exprimare a subunității BAF60C a remodelării cromatinei complexe SWI/SNF 18. de alegere pentru a caracteriza mai bine mecanismele de reprimare a genelor indusă de MyoD. Este, de asemenea, potrivit pentru testarea capacității MyoD de a induce mediul de cromatină represivă la locurile țintă cu partenerii săi asociați și, prin urmare, pentru a descoperi mecanisme represive dependente de MyoD în proliferarea mioblastelor pentru a rafina diferențierea terminală.

Aici descriem protocolul pentru identificarea partenerilor MyoD folosind Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) cuplat cu caracterizarea spectrometriei de masă (MS). Utilizarea celulelor HeLa care exprimă stabil S3 Flag-HA MyoD a furnizat suficient material pentru a purifica complexele MyoD din extracte nucleare fracționate. Identificarea partenerilor MyoD în sistemul heterolog a fost urmată de validare într-un sistem relevant.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

1. Prepararea fracțiunilor HeLa-S3 nucleare extrase de sare și legate de cromatină

2. Complexe de purificare a proteinelor

Notă: Procedați în extrase paralele din fiecare linie celulară (HeLa-S3 Flag-HA-MyoD și control, Hela-S3 Flag-HA).

3. Analiza spectrometriei de masă

Notă: Următorii pași trebuie discutați cu instalarea de spectrometrie de masa care va efectua analiza.

  1. Adăugați probe de 3/4 (22,5 µl) cu 7,5 µl de tampon de încărcare 4x și 3,3 µl de agent de reducere 10x și fierbeți timp de 5 minute la 96 ° C.
  2. Încărcați probele pe un gel SDS-poliacrilamidă 4 - 12%. gel Funcționează la 150 V constantă timp de 5 minute pentru a permite tuturor proteinelor să pătrundă în gel fără separare.
  3. Spălați gelul cu apă; se fixează 20 - 30 min cu o soluție fixativă (10% acid acetic, 50% metanol, 40% apă ultra-curată) apoi se spală gelul fix de 5 ori în apă ultra-curată.
  4. Tăiați benzile care conțin proteinele, păstrați-le în 1 ml de apă într-un tub de 1,5 ml și trimiteți-le la instalația de spectrometrie de masă.

Analiză 4. Date

Notă: Acesta este un ghid general pentru analiză. Pașii exacți depind de modul particular de date furnizat de instalarea MSfolosit pentru efectuarea analizei (de exemplu, 21,22).

  1. Comparați lista proteinelor identificate în eluatele "MyoD" cu lista obținută din preparatul de control negativ corespunzător. Excludeți din analiză proteinele prezente în ambele liste.
  2. Eliminați proteinele care au ≤2 numărul total de peptide identificate din lista rămasă.
  3. Accesați adnotarea funcțională și clasificarea funcțională a listei obținute de proteine ​​utilizând resursele DAVID Bioinformatics (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) și clasificați lista de proteine ​​23,24.
  4. (Opțional) Eliminați din listă „autostopiști”, proteine ​​non-nucleare încărcate cu o adventie puternică de legare a ADN-ului cu sarcină negativă 25. Acestea conțin proteine ​​cito-scheletice, citoplasmatice, mitocondriale, de membrană și de receptor (plierea proteinelor, citoscheletului și a diferitelor proteine ​​de grup din tabelele 1 și 2).
  5. Comparați listele rezultate de interacțiuni MyoD ale fracțiunilor SE și NE pentru a identifica proteinele comune specifice și proteinele pentru fiecare fracție (Figura 2).

5. Confirmarea interactorilor identificați de Western Blot

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

Pentru a înțelege reglarea activității MyoD, am întreprins caracterizarea exhaustivă a complexelor MyoD folosind purificarea biochimică, pe baza imunopurificării unei forme dublu etichetate de MyoD urmată de spectrometrie de masă (MS). Utilizarea liniei de celule MyoD marcate cu Flag-HA care exprimă HeLa-S3 și a unei linii de celule de control care exprimă Flag-HA a permis obținerea unui material suficient pentru purificarea complexului MyoD prin efectuarea purificării cu dublă afinitate a Flag-HA-MyoD.

Extractele celulare sunt fracționate în fracții citoplasmatice și nucleare, apoi fracționate în continuare fracția nucleară a sării extrase (sare extractibilă nucleară, SE) și îmbogățite în nucleozomi (nucleozom NE, îmbogățit în fracțiuni). Purificarea TAP-Tag din aceste fracțiuni nucleare separate (figura 1, tabelele 1 și 2) le-a permis dezlegarea partenerilor care au o abundență relativ mică atunci când sunt localizați într-un anumit compartiment subnuclear. În plus, o astfel de strategie a fost exploatată pentru a descoperi parteneri de MyoD nelegat (SE) versus legat de ADN (NE) pentru a obține o perspectivă asupra reglementării activității MyoD.