Inducerea inflamației intestinale murine prin transfer adoptiv al efectorului CD4 CD45R Celule T înalte

Abstract

Există multe modele diferite de animale pentru studierea patogeniei bolii inflamatorii intestinale umane (IBD), fiecare cu propriile avantaje și dezavantaje. Descriem aici un model experimental de colită care este inițiat prin transferul adoptiv al celulei T crescute a splinei CD4 + CD45RB în receptorii șoarecilor cu deficit de celule T și B. Populația mare de celule T CD4 + CD45RB, compusă în mare parte din celule efectoare naive, poate induce inflamații intestinale cronice, foarte asemănătoare cu aspectele importante ale IBD umane. Această procedură poate fi manipulată pentru a examina aspectele de debut și progresie a bolii. În plus, poate fi folosit pentru a studia funcția populațiilor de celule imune înnăscute, adaptative și reglatoare și rolul factorilor de mediu, adică a microflorei în inflamația intestinală. În acest articol explicăm metoda de inducere a colitei utilizând un protocol pas cu pas. Aceasta include o demonstrație video a aspectelor tehnice cheie necesare pentru a dezvolta cu succes acest model de șoarece de colită experimentală în scopuri de cercetare.

Protocol

NOTĂ: Asigurați-vă că toate protocoalele animalelor sunt aprobate de și în conformitate cu regulamentele Comitetului instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor (IACUC) și cu Manualul Consiliului Național de Cercetare pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator. Șoarecii donatori pot fi bărbați sau femele, dar șoarecii destinatari ar trebui să fie bărbați. În cazul în care femeile destinatarilor vor fi utilizate, șoarecii donatori trebuie să fie femele 5. Mențineți coloniile în mod regulat, folosind paturi nesterile și apă neacidă, deoarece acestea afectează flora intestinală și astfel fenotipul colitei șoarecilor 5,6.

  1. Utilizați medii și tampoane pentru gheață. Păstrați celulele pe gheață în timpul experimentului.
  2. Efectuați experimentul în hota sterilă cu pericol biologic folosind tehnologia sterilă.

2. Izolarea celulelor T splenice

3. Îmbogățirea celulelor T CD4 +

Notă: Respectați instrucțiunile producătorului pentru produse specifice utilizate în această secțiune.

4. Etichetarea și sortarea celulelor 7

intestinale
Figura 1: Diagramele reprezentative de citometrie în flux a populațiilor de celule T CD4 + CD45RB în timpul analizei FACS (A. - C) Splenocitele colorate FITC CD4 și PE CD45RB de la șoareci donatori C57BL/6 au fost sortate după FACS în CD4 + CD45RB înalt și CD4 +. CD45RB populații de celule T scăzute. (A) Evenimente de dublet excluse pe diagrama de dispersie frontală. (B) Limfocitele au fost închise în graficele de dispersie înainte și laterală. (C) Celulele T CD4 + au fost închise și (D) Celulele T CD4 + CD45RB + au fost reprezentate grafic pe o histogramă PE versus evenimente. Celulele scăzute CD4 + CD45RB au fost considerate a fi cel mai mic 20% din celulele CD45RB +. Celulele înalte CD4 + CD45RB au fost determinate a fi cele mai mari 40% celule CD45RB +.

  1. Rulați o alicotă a fiecărei populații de celule pe mașina FACS pentru a evalua puritatea populației.
  2. Centrifugați celulele sortate la 450 g timp de 7 minute. Se resuspendă în 1 ml PBS. Eliminați alicote de celule pentru a număra și a evalua viabilitatea celulei prin excluderea albastru trypan ca la pasul 2.9.

5. Injectarea celulelor în receptori

  1. Resuspendați celulele sortate la 4 x 106 celule/ml (CD45RB înalt) sau 2 x 106 celule/ml (CD45RB scăzut) în PBS.
  2. Transferați 100 μl de celule CD45RB înalte pentru fiecare recipient în tuburi sterile noi. Adăugați 100 pl de PBS per recipient la acest tub. Cantitatea totală injectată pe animal este de 200 μl, iar cantitatea totală de celule per recipient este de 4 × 105 CD4 + CD45RB celule T foarte naive.
  3. Dacă se dorește grupul experimental care conține celule T reglatoare, atunci adăugați 100 pl de celule CD45RB per recipient la noi tuburi sterile. 100 μL de celule scăzute CD45RB per recipient pe același tub. Cantitatea totală de injecție per animal este de 200 pl; Raportul CD45RB ridicat: celulele CD45RB scăzute este 2: 1.
  4. Injectați 100 μl de CD45RB ridicat sau CD45RB ridicat/scăzut CD45RB CD4 + celule CD4 + intraperitoneal în partea dreaptă și stângă a abdomenului (200 μl total) a fiecărui destinatar.

6. Monitorizarea progresiei bolii la animalele primitoare

  1. Pentru a evalua starea clinică a animalelor primitoare, scorurile clinice generale pentru următorii parametri atribuie 8 în ziua injectării, săptămânal după aceea și la sacrificiu:
    1. Determinați risipa prin măsurarea pierderii în greutate: 0 - fără pierderi în greutate; 1 - 0,1 până la 10% pierderea din greutatea corporală inițială; 2 - pierderea mai mult de 10% din greutatea corporală inițială (Figura 2A).

inflamației
Figura 2: Semnele clinice și patologice ale inflamației după transferul celulelor T crescute CD4 + CD45RB de tip sălbatic apar la șoarecii care primesc Rag1 -/- și NRDKO 11 (A) Beneficiarii NRDKO au pierdut în medie 10% din greutatea corporală inițială 5. Săptămâni după transmitere, în timp ce Rag1/destinatarii nu prezintă semne clinice de boală în acel moment. Fiecare punct reprezintă procentul mediu din greutatea corporală inițială pentru cohorta ± SEM. ** Șoarecii receptor P -/- și NRDKO sunt îngroșați și scurtați în comparație cu colonii de la șoarecii Rag1 -/- și NRDKO fără transfer adoptiv de celule T. Coloanele de la șoarecii care primesc NRDKO prezintă inflamație severă și obezitate crescută (datele nu sunt prezentate). Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

Aproximativ. 10 x 106 celule T CD4 + CD45RB cu conținut ridicat de la 10 spline de șoareci donatori C57BL/6 adulți sunt izolate în mod fiabil. Acest număr va varia în funcție de vârsta și tulpina șoarecelui donator și de calitatea cercetătorului. Când 4 x 105 C57BL/6 CD4 + CD45RB celule T crescute sunt transferate în șoareci primitori C57BL/6 Rag1 -/-, semnele clinice ale bolii apar la aproximativ 5 săptămâni după saturație sau mai devreme dacă șoarecii sunt predispuși genetic la boli mai severe ( Figura 2, 3) 11.12. Celulele T CD3 + pot fi văzute în colon la receptorul Rag1 -/- încă din 3 săptămâni (3A) Al 12-lea.

inducerea
Figura 3: Transmiterea CD4 de tip sălbatic + Celulele T cu CD45RB ridicate la receptorii Rag1 -/- și RKO/δ KD induc inflamația cronică a intestinului 12 (A) (Mărire originală 10X, H&E și CD3 Imunohistochimie). Colorarea H&E (panourile superioare) prezintă hiperplazie epitelială, celule inflamatorii infiltrate și abcese criptice (săgeată) prezente în receptorul RKO/δ KD, dar nu și receptorul Rag1 -/-. Coloanele de la șoarecii destinatari RKO/δ KD au prezentat o acumulare semnificativă de celule T CD3 + de către CD3 IHC (plăci de jos) comparativ cu colonii de la primitorii Rag1 -/-. (B) Coloanele de la șoarecii primitori RKO/δ KD au prezentat inflamații mai severe comparativ cu colonii de la șoarecii primitori Rag1 -/- așa cum a fost determinat de scorurile histologice. (C, D) Culturile de explante colonice de la șoareci primitori de RKO/δ KD au secretat mai puțin IL-10 (C) și IL-12p40 (D) decât făcut culturi explant de colon de Rag1 -/-. Șoarecii receptor vă rugăm să faceți clic aici pentru a vizualiza versiunea mai mare a imaginii.

Am publicat anterior că transferul de celule T adoptiv la Nfil3 -/-/Rag1 -/- destinatarii dublu knockout (NRDKO) dezvoltă colită severă în comparație cu Rag1 -/- șoareci primiți (Figura 2) 11. NFIL3 reglează negativ IL-12p40 în macrofagele de colon murin, indiferent de efectul său de inducere a IL-10. 13. Reglarea IL-12p40 și IL-10 se află în patogeneza IBD umană 1. Astfel, producția IL-12p40 necontrolată în transferul adoptiv Șoarecii care primesc NDRKO au ca rezultat o progresie mai rapidă a bolii, cum ar fi pierderea în greutate (2A) afișate. Unii șoareci primitori de NRDKO au dezvoltat boli grave, ducând la prolapsul intestinului (2 B). Coloanele grosiere de la șoarecii primitori NRDKO sunt îngroșate și scurtate, rezultând o imigrație mare de celule inflamatorii în colon, comparativ cu șoarecii primitori Rag1 -/- (2C).

Comparativ la șoarecii Rag1 -/- cu o unitate catalitică nefuncțională p110 δ PI3K la populațiile non-limfocitare (RKO/δ KD), CD4 + CD45RB cu reîncărcare cu celule T indusă a avut un curs clinic similar și rapid al bolii comparativ cu Șoareci NRDKO (3) 12. Analiza histologică după 3 săptămâni arată hipertrofia țesutului colonului, inflamația, infiltratele de celule conservatoare și abcesele criptelor (săgeată) la destinatarul RKO/δ KD comparativ cu receptorul Rag1 -/- (3A). Șoarecii beneficiari din acest experiment au fost eutanasiați timp de 3 săptămâni din cauza unui număr semnificativ care a pierdut 20% din greutatea lor inițială. Scorurile histologice, orbite de grupurile de test de către un patolog și determinate pe baza criteriilor specifice dezvoltate în laboratorul nostru 12, comparativ cu Rag1 au fost mai mari la șoarecii primitori RKO/δ KD -/- șoarecii primitori (3B). În plus, producția spontană de citokine din culturile de explant de colon a arătat o producție redusă de IL-10 și IL-12p40 de către șoareci primitori RKO/δ KD comparativ cu șoareci primitori Rag1 -/- (3C, D) 12. Din nou, creșterea IL-12p40 și scăderea producției de IL-10 implicate în patogeneza IBD 1 umană.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

Aici descriem un protocol pas cu pas de inducere a inflamației colonului la șoareci prin transfer adoptiv al celulelor T CD4 + CD45RB + la șoareci imunodeficienți. Am folosit splina donatorului C57BL/6 și șoarecii receptorii Rag1 -/- syngeneic, deși alte tulpini (de exemplu, BALB/c, 129S6/SvEv, diabetic non-obez (NOD)) și modele genetice de imunodeficiență (de exemplu SCID, Rag2 -/- ), poate fi folosit și 4,14-16. Este bine cunoscut faptul că tulpina de fond influențează severitatea colitei experimentale la șoareci 1. În plus, microflora enterică la o populație murină variază semnificativ între instituții, inclusiv între cele din aceeași instituție 6,17. In timp ce 2 și 3 nu a arătat dezvoltarea colitei la șoareci Rag1 -/- după 4 săptămâni după transfer, în experiența noastră și a altor destinatari Rag1 -/- pentru a dezvolta boala clic între 6 și 9 săptămâni după transferul CD4 + CD45RB high -T -Celule 18-23. Această variabilitate a evoluției clinice și a expresiei bolii și ar trebui menținută cât mai scăzută posibil atunci când stabiliți acest model de colită experimentală la inconsistență intra și inter-experimentală.

Pașii protocolului care necesită optimizare sunt Secțiunea 3: Îmbogățirea celulelor T CD4 + și Secțiunea 4: Etichetarea și sortarea celulelor. Optimizarea îmbogățirii celulelor T CD4 + depinde de sistemul magnetic utilizat și ar trebui să respecte instrucțiunile producătorului. Opțiunile sistemului de separare a celulelor magnetice sunt furnizate în Tabel cu reactivi/accesorii specifici enumerate. Se recomandă îmbogățirea celulelor T CD4 + prin selecție negativă, deoarece etichetarea directă a acestei populații poate afecta fenotipul celulelor. Există multe clone de anticorpi disponibile pentru marcarea celulelor pentru FACS. Concentrația de anticorpi (etapa 4.4) ar trebui optimizată pentru a asigura colorarea specifică și separarea adecvată a populațiilor de celule T CD4 + CD45RB în timpul FACS.

Aici descriem metodologia modelului murin de transfer adaptiv bine caracterizat al inflamației cronice a intestinului subțire și a colonului care seamănă cu IBD 5 uman. Acest protocol pas cu pas oferă tehnici cheie pentru dezvoltarea cu succes a acestor proceduri în scopuri de cercetare. Acesta este un model animal deosebit de util al IBD uman, deoarece permite sincronizarea bolii și manipularea diferitelor populații de celule. Cu toate acestea, șoarecii primitori imunocompromiși sunt modificați genetic fără a dezvolta celule imune adaptive mature, care sunt susceptibile să afecteze procesele bolii din aval. Cu toate acestea, metoda descrisă aici se va dovedi foarte utilă în studiile viitoare care determină efectele microflorei enterice, ale celulelor sistemului imunitar înnăscut și ale celulelor regulatoare ale sistemului imunitar adaptativ în patogeneza IBD umană.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută de Societatea Americană pentru Gastroenterologie (AGA) Research Scientists Award și Crohn and Colitis Foundation of America (CCFA) Career Development Award (SZS), NIH NIDDK F30 DK089692 (ECS) și Universitatea din Carolina de Nord Centrul de Biologie Gastrointestinală și subvenții pentru boli P30 DK34987 (nucleu histologic). Facilitatea de bază UNC pentru citometrie de flux este susținută parțial de o subvenție de sprijin pentru centrul NCI Center (P30CA016086) la Centrul de cancer al UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. Mulțumim lui Lukas B. Borst de la Colegiul de Medicină Veterinară al Universității de Stat din Carolina de Nord pentru ajutor cu analiza histopatologică și imunohistochimie.