Influența mastocitei asupra vindecării cutanate a rănilor ale rănilor cutanate infectate cu Pseudomonas aeruginosa

De la Clinica de Dermatologie, Venereologie și Alergologie a Facultății de Medicină Charité Universitätsmedizin Berlin DISSERTARE Influența mastocitei asupra vindecării cutanate a rănilor cutanate infectate cu Pseudomonas aeruginosa pentru obținerea diplomei universitare Doctor medicinae (Dr. med.) Prezentat la Facultatea de Medicină Charité Universitätsmedizin Berlin de Daniel Tröltzsch din Karl-Marx-Stadt/acum Chemnitz Data doctoratului: 04.09.2015-1 -

Dedicat părinților mei Recenzor: 1. 2. 3. Data doctoratului. - 2 -

Cuprins Rezumat. Abstract. Stabilirea obiectivelor. 1. Introducere. 1 1.1. Bazele biologiei mastocitelor. 1 1.1.1. Introducere. 1 1.1.2. Caracteristicile mastocitelor. 2 1.1.3. Model de distribuție și eterogenitate. 3 1.1.4. Originea și dezvoltarea. 5 1.1.5. Fiziologia și funcțiile mastocitelor. 7 1.1.6. Competențe imunologice ale mastocitei. 11 1.2. Rolul mastocitei în imunitatea naturală la bacterii. 12 1.2.1. General. 12 1.2.2. Bacteria Pseudomonas aeruginosa. 14 1.2.3. Peptidele antimicrobiene și proteazele MZ și rolul lor în apărarea imună mediată de MZ. 15 1.3. Vindecarea cutanată a rănilor. 16 1.3.1. Prezentare generală. 16 1.3.2. Fazele și mecanismele de vindecare a rănilor. 17 1.3.3. Vindecarea rănilor și mastocitele - stadiul cercetării. 20 2. Material și metode. 22 2.1. Animale. 22 2.1.1. Kit W/Kit W-v - modelul mouse-ului. 22 2.1.2. Reconstituire. 23 2.2. Experiment de vindecare a rănilor cu șoareci de tip sălbatic și deficienți de MZ. 23 2.2.1. Anestezie. 23 2.2.2. Răni, infecție și control. 23 iii

2.2.3. Măsurarea rănilor. 24 2.2.4. Histologie. 25 2.3. Sarcina bacteriană pe rană. 26 2.4. Celulele. 27 2.4.1. Obținerea și cultivarea MZ cultivate (BMCMC) derivate din măduva osoasă. 27 2.4.2. Obținerea celulelor mastocitare peritoneale (PMC). 28 2.4.3. Separarea celulară magnetică (MACS). 28 2.4.4. Cultivarea PCMC-urilor. 28 2.4.5. Analiza FACS. 29 2.5. Cultivarea culturii Pseudomonas aeruginosa. 30 2.6. Testul β - hexozaminidazei. 30 2.7. Determinarea ratei de supraviețuire a bacteriilor. 31 2.8. Citospin. 32 2.9. PCR cantitativă în timp real (q-rt-pcr). 32 2.9.1. Grund. 32 2.9.2. Stimularea PCMC-urilor. 34 2.9.3. Izolarea ARN-ului. 34 2.9.4. Determinarea purității și concentrației ARN-ului. 35 2.9.5. Rescrieți în cdna. 35 2.9.6. Procedura PCR cu LightCycler. 36 2.10. Analize statistice. 37 3. Rezultate. 39 3.1. Cursul de vindecare a rănilor la șoarecii Kit W/Kit W-v cu deficiență de MZ după infecția cu bacteria Pseudomonas aeruginosa este întârziat. 39 3.2. Vindecarea normală a plăgilor rănilor infectate cu Pseudomonas aeruginosa este dependentă de celulele mastocite. 43 3.3. Confirmarea histologică a reconstituirii cu succes a șoarecilor cu W/Kit W-v - cu deficiență de MZ cu BMCMC. 46 3.4. Animalele cu răni infectate cu PA nu prezintă semne sistemice de infecție. 49 iv

3.5. MZ reduce sarcina bacteriană a rănilor infectate cu Pseudomonas aeruginosa. 51 3.6. Bacteria Pseudomonas aeruginosa și componentele sale nu duc la degranularea mastocitelor peritoneale cultivate (PCMC). 53 3.7. MZ reduce rata de supraviețuire a bacteriei Pseudomonas aeruginosa în cocultură. 55 3.8. Detectarea expresiei unei selecții de peptide antimicrobiene și proteaze secretate de MZ după stimularea cu LPS și PA. 57 3.9. Pseudomonas aeruginosa și LPS schimbă expresia proteazelor specifice MZ și a peptidelor antimicrobiene într-o mică măsură după 4 și 24 de ore de stimulare. 59 3.10. Mastocite peritoneale cultivate ca model pentru mastocite ale pielii. 61 4. Discuție. 64 5. Bibliografie. 77 6. Afidavit. 99 7. Curriculum Vitae. 100 8. Mulțumiri. 101 î.Hr.

Obiectiv in vivo: 1. Prezentarea tendinței modificate de vindecare a rănilor la șoarecii de tip sălbatic Kit +/+ - și deficienți ai șoarecilor Kit W/Kit Wv după infecția cu bacteria Pseudomonas aeruginosa (pa) 2. Dovezi ale dependenței MZ a tulburărilor de vindecare a rănilor bacteriene prin reconstituirea MZ șoareci deficienți care utilizează BMCMCs 3. Determinarea comparativă a încărcăturii bacteriene în rănile Kit +/+ - și Kit W/Kit Wv - șoareci după 24 de ore de infecție PA in vitro: 4. Investigarea activării MZ de către PA, precum și a componentelor selectate a acestei bacterii 5. Detectarea cantitativă a eliminării directe a PA de MZ în co-cultură 6. Identificarea peptidelor antimicrobiene secretate sau a proteazelor MZ după stimularea bacteriană și cuantificarea expresiei acestora prin PCR în timp real cantitativ viii

Tabelul 1 Proprietățile mucoasei murine și ale celulelor mastocitare ale țesutului conjunctiv (Galli, 1990) Mucoasa MZ (MMC) Țesutul conjunctiv MZ (CTMC) Apariție Epiteliu bronșic, mucoasă intestinală Piele, plămâni, peritoneu Durată de viață Aproximativ 40 de zile Câteva luni până la ani Ultrastructura granulelor Mici, heterogene cu densitate electronică Dezvoltare mare, omogenă, densă de electroni, dependentă de celule T Da Nu Cel mai important proteoglican intragranular Sulfat de condroitină Heparină Poate fi colorat cu albastru de Alzian Albastru de Alzian, sulfat de berberină, safranină Conținutul de histamină al granulelor Conținut scăzut de serotonină al granulelor Prezență variabilă scăzută a receptorilor IgE cu afinitate ridicată 48/80 Nu Activare Da, în cadrul populațiilor de mastocite umane, se face o distincție în ceea ce privește modelul de expresie al triptazei și chimazei, două proteaze de mastocite cunoscute. Celulele pozitive cu triptază și chimază sunt localizate în piele, în timp ce mastocitele cu triptază pozitivă domină în plămâni (Irani și colab., 1986; Miller și Schwartz, 1989; Welle și colab., 1997). - al patrulea -

PCR a fost evaluată prin intermediul cuantificării relative pe baza β-actinei ca genă de menaj, cu care raportul dintre eșantionul stimulat și cel nestimulat (raportul) ar putea fi determinat folosind următoarele formule: Raport = 2 -ΔΔCt ΔΔCt = ΔCt (stimulat) - ΔCt nestimulat) ΔCt = Ct (gena țintă) Ct (gena de menaj). Valoarea Ct (pragul ciclului) descrie ciclul PCR la care fluorescența crește mai întâi semnificativ. 2.10 Analize statistice Evaluarea statistică a rezultatelor acestei lucrări a fost efectuată utilizând următoarea metodă: Calculul valorii medii M: M 1 nnxii 1 n Numărul valorilor măsurate xi Valoarea valorii măsurate i Deviația standard SD a valorii medii: SD 1 n 1 nxi M i 1 2 Eroare standard SEM des Valoare medie: SD SEM n - 37 -

Toate seturile de date au fost analizate pentru semnificație utilizând un test t Student pentru două fețe pentru eșantioane neconectate: Calculul valorii: t M 2 1 1 1 SD n M 2 SD n 2 2 2 M 1: valoarea medie a eșantionului 1 M 2: valoarea medie a eșantionului 2 SD 1 Abaterea standard a valorilor medii ale populației 1 SD 2 Abaterea standard a valorilor medii ale populației 2 n 1 Numărul de valori măsurate în eșantion 1 n 2 Numărul de valori măsurate în eșantion 2 O valoare de probabilitate (p]) de p 0,05 ca fiind nesemnificativă vizualizat. Toate datele au fost prezentate ca medie ± SE. Analizele statistice au fost efectuate folosind software-ul Statview (Statview pentru Windows, SAS Institute Inc., Cary, NC, SUA). - 38 -

Figura 1a Kit +/+ (neinfectat) 1,5 cm 0h 6h 12h Ziua1 Ziua2 Ziua3 Ziua4 Ziua5 Ziua6 Ziua7 Ziua8 Ziua9 Ziua + Kit +/+ (infectat) 1,5 cm 0h 6h 12h Ziua1 Ziua2 Ziua3 Ziua4 Ziua5 Ziua6 Ziua7 Ziua8 Ziua9 Figura 1b Kit W/Kit Wv (neinfectat) 1,5 1,5 cm cm 0h 6h 12h Day1 Day2 Day3 Day4 Day5 Day6 Day7 Day8 Day9 Kit W/Kit Wv (infectat) 1,5 1,5 cm cm 0h 6h 12h Day1 Day2 Day3 Ziua4 Ziua5 Ziua6 Ziua7 Ziua8 Ziua9 Figura 1 a/b: Zona plăgii a șoarecilor cu deficit de MZ infectați cu Pseudomonas aeruginosa este mărită. Aceste răni au fost infectate cu 10 μl de suspensie Pseudomonas aeruginosa (PA) la o concentrație de 6,5 × 105 PA/10 μl sau cu 10 μl de PBS ca martor negativ și fotografiate la intervalele de timp descrise. Imaginile reprezentative ale închiderii plăgii unui animal la momente specificate sunt prezentate cu o scală identică de 1,5 cm. Figura 1a Kit de tip sălbatic +/+ - șoareci, Figura 1b Kit cu deficit de MZ W/Kit W-v - șoareci. - 41 -

* ** ** * * * * * * Figura 2: Cursul de vindecare a rănilor la rănile infectate cu Pseudomonas aeruginosa este întârziat la șoarecii Kit W/Kit W-v cu deficit de MZ. Șoarecii infectați + + + + (n = 9), șoarecii infectați cu kit W/Kit Wv (n = 6) și controalele corespunzătoare (n = 10 sau n = 6) au fost tratați individual cu răni în zona caudală din spate Vindecarea a fost documentată. Este prezentat procesul de vindecare a rănilor pe parcursul a 9 zile, reprezentat grafic ca suprafață procentuală a rănilor rănite în ziua 0. Datele sunt rezumate din 2 experimente independente, cu n = 6-10 animale pe grup și date ca medie ± SEM; * = p 1 corespunde, de exemplu, cu triptaza 1 sub LPS (2,9 ori ± 1,3 SEM) și PA (2,2 ori ± 0,3 SEM), catepsina G sub LPS (2,2- ori ± 1,0 SEM) și PA (1,4 ori ± 0,1 SEM), MCPT8 sub LPS (2,6 ori ± 0,8 SEM) și PA (1,6 ori ± 0,2 SEM ), MCPT9 sub LPS (3,1 ori ± 1,5 SEM), precum și Granzym B sub LPS (2,0 ori ± 0,6 SEM) și sub PA (2,9 ori ± 1,5 SEM) . În schimb, expresia MCPT9 a fost reglată în jos sub stimulare PA (0,7 ori ± 0,1 SEM). O reglare descendentă a anumitor proteine și proteaze este cauzată de valori