Inhibarea hemicanalelor de conexină ameliorează steatohepatita fără alcool la șoareci

subiecte

abstract

introducere

Boala hepatică grasă nealcoolică (NAFLD) este cea mai frecventă boală hepatică cronică, cu o prevalență estimată de 25% la nivel mondial 1. NAFLD reprezintă un spectru de boli care variază de la steatoza hepatică la steatohepatita fără alcool (NASH), fibroza hepatică, ciroză hepatică și în cele din urmă carcinomul hepatocelular 2. Steatoza hepatică poate fi cauzată de un aflux crescut de acizi grași dintr-o dietă bogată în grăsimi, rezistența la insulină, medicamente și factori genetici. Ca atare, steatoza se caracterizează printr-o acumulare de picături lipidice pe bază de trigliceride în citosolul hepatocitelor 3. Steatoza hepatică se poate dezvolta în NASH ca răspuns la o serie de factori declanșatori, cum ar fi citokinele inflamatorii, adipokinele, speciile reactive de oxigen și stresul reticulului endoplasmatic 4 .

Rezultate

Efectele TAT-Gap24 și TAT-Gap19 asupra activității joncțiunii decalajului și a răspunsurilor hemicanalului conexinei

TAT-Gap24 și TAT-Gap19 imită o secvență de aminoacizi în regiunea buclei intracelulare a Cx32 și, respectiv, Cx43. S-a constatat că Gap19 se leagă de regiunea C-terminală a Cx43, întrerupând astfel interacțiunea dintre bucla intracelulară și regiunea C-terminală, care, la rândul său, inhibă deschiderea hemicanalului Cx43 12. Se crede că un mecanism similar stă la baza acțiunilor TAT-Gap24 asupra hemicanalelor Cx32. Pentru a evalua specificitatea TAT-Gap24 și TAT-Gap19 pentru blocarea hemicanalelor Cx, dar nu a joncțiunilor gap, recuperarea fluorescenței după analiza fotobleaching (FRAP) a fost efectuată în culturile de hepatocite de șobolan (n = 4, N = 4) . În special, hepatocitele de șobolan au fost expuse la 20 uM TAT-Gap19, 20 uM TAT-Gap24, 50 uM carbenoxolonă (CBX), un inhibitor cunoscut al canalelor Cx 17 sau la un vehicul de control timp de 24 de ore și 48 de ore, 24 de ore după placare. Atunci când este utilizat cu 20 μM, TAT-Gap24 și TAT-Gap19 nu au indus citotoxicitate în culturile de hepatocite ale șobolanului primar (suplimentar 1). CBX a redus recuperarea fluorescenței după 24 de ore (p

hemicanalelor

inhibarea

Efectele TAT-Gap24 și TAT-Gap19 asupra expresiei proteinelor conexinei în ficat. După 8 săptămâni de CHFD, a fost implantată chirurgical o pompă osmotică în cavitatea abdominală care a asigurat o eliberare susținută de 1 mg/kg/zi de TAT-Gap24 (n = 11) sau TAT-Gap19 (n = 12) sau de soluție salină (n =) 14 ) încă 2 săptămâni în timp ce dieta continuă. Analiza imunoblot a Cx26 (21 kDa), Cx32 (27 kDa) și Cx43 (43 kDa) după separare și ștergere, după care rezultatele au fost normalizate la încărcarea totală de proteine. Imaginile patch-uri sunt tăiate. Bloturile pe toată lungimea sunt prezentate în Suplimentar 4. Datele sunt exprimate ca mijloace ± SEM.

Efectele TAT-Gap24 și TAT-Gap19 asupra parametrilor biometrici, histologia ficatului și transaminazele serice

Greutatea relativă a grăsimii a fost mai mult decât dublată și a fost la șoareci hrăniți cu CHFD (n = 14) comparativ cu șoareci hrăniți cu ND (p 22. Toate scorurile au fost 0 în grupul hrănit cu ND (n = 10) și a existat unul Creșterea scorului de steatoză (p

ameliorează

Efectele TAT-Gap24 și TAT-Gap19 asupra parametrilor biometrici și a histologiei ficatului în NASH. După 8 săptămâni de CHFD, o pompă osmotică a fost implantată chirurgical în cavitatea abdominală, asigurându-se o eliberare susținută de 1 mg/kg/zi de TAT-Gap24 (n = 11) sau TAT-Gap19 (n = 12) sau soluție salină (n =) 14 ) încă 2 săptămâni în timp ce continuați dieta. A ) Corpul, grăsimea și ficatul șoarecilor și greutățile relative ale ficatului și grăsimii. ( ) Steatoză, inflamație lobulară, formarea balonului și scor NAS pe baza colorării hematoxilin-eozinei a țesutului hepatic din grupul ND (primul panou), grupul salin (al doilea panou), TAT-Gap24 (al treilea panou) și grupul TAT-Gap19 Panou) panou). Datele sunt prezentate ca medie ± SEM cu * p

inhibarea

Efectele TAT-Gap24 și TAT-Gap19 asupra citokinelor inflamatorii și a stresului oxidativ în NASH. După 8 săptămâni de CHFD, o pompă osmotică a fost implantată chirurgical în cavitatea abdominală, asigurându-se o eliberare susținută de 1 mg/kg/zi de TAT-Gap24 (n = 11) sau TAT-Gap19 (n = 12) sau soluție salină (n =) 14 ) încă 2 săptămâni în timp ce continuați dieta. ( A ) Niveluri de IFN-γ, IL-6, IL-1β, TNF-α și IL-10 în țesutul hepatic și ser. ( ) Activitatea SOD, GR, GPx și catalază în țesutul hepatic. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM cu * p 27. Acest lucru se aplică și glutation reductazei (GR), glutation peroxidazei (GPx) și catalazei ca enzime antioxidante 28. De fapt, șoarecii și pacienții umani cu NASH au niveluri scăzute de glutation, SOD și activități catalazice 27, 29. Interesant este că în ficatul șoarecilor hrăniți cu CHFD (n = 14) s-au găsit GPx mai mari (p 30) Efecte similare (p 31. Pentru antigenul limfocitar (LY) 86 nu s-au găsit diferențe la nivelul proteinelor (6 și 5 suplimentare).

ameliorează

2, 5 u M 12 se leagă, permițând capturarea și reținerea peptidei intracelular. Se crede că Gap24 răspunde similar cu Cx32 18. Atât șoarecii NASH tratați cu TAT-Gap24, cât și cei tratați cu TAT-Gap19 au prezentat niveluri reduse de trigliceride, colesterol, IL-1β și cantități mai mari de SOD în țesutul hepatic. În plus, TAT-Gap19 a scăzut, de asemenea, nivelurile de ALT și TNF-α, în timp ce șoarecii tratați cu TAT-Gap24 au avut niveluri mai mici de IFN-γ. - și avea niveluri de IL-6. Trebuie subliniat, totuși, că efectele nespecifice ca atare din cauza lipsei controlului peptidelor din ouă amestecate nu pot fi complet exclus din acest studiu. Nivelurile de activitate SOD, catalază, GR și GPx sunt de obicei scăzute în timpul NASH 27, 29 deoarece speciile de oxigen reactiv supraprodus pot descompune direct moleculele antioxidante și inhiba activitățile enzimelor antioxidante 44. Deoarece catalaza, GPx și SOD își exercită activitatea enzimatică în strânsă relație 44, o scădere a catalazei și a activității GPx ar putea reflecta un mecanism compensator pentru nivelurile crescute de activitate SOD.

Pe scurt, inhibarea hemicanalelor Cx poate deschide perspective pentru stabilirea de noi strategii terapeutice pentru tratamentul NASH.

materiale si metode

Animale și tratament

Izolarea și cultivarea hepatocitelor

Șobolanii Sprague-Dawley masculi (Laboratoarele Charles River, Belgia) au fost adăpostiți în condiții de mediu controlate, cu acces gratuit la alimente și apă. Hepatocitele au fost izolate folosind o procedură de perfuzie în două etape a colagenazei, inclusiv purificarea prin centrifugare diferențială în serie, iar viabilitatea celulară a fost evaluată prin excluderea albastru trypan. Hepatocite viabile (≥ 85%) la o densitate de 0,56 × 105 celule pe cm 2 în William's Medium E (Invitrogen, SUA), suplimentat cu 7 ng/ml glucagon, 292 mg/ml L-glutamină, antibiotice ( 7, 33 UI), benzilpenicilină sodică placată, 50 ug/ml monosulfat de kanamicină, 10 ug/ml amficilină sodică și 50 ug/ml sulfat de streptomicină) și 10% ser fetal bovin. După 4 h, 24 h și 48 h, mediul de cultură celulară a fost îndepărtat și înlocuit cu mediu fără ser conținând 25 μm. g/ml hemisuccinat de sodiu hidrocortizon și 0,5. s-a suplimentat g/ml insulină. Procedurile de adăpostire a șobolanilor, precum și izolarea și cultivarea hepatocitelor au fost aprobate de Comitetul de etică pentru experimente pe animale din Vrije Universiteit Brussel (numărul proiectului 14-210-1), iar toate animalele au fost testate conform criteriilor Ghidului pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator. ".

Recuperarea fluorescenței după albire foto

Pentru analiza FRAP la 24 de ore după placarea celulei, hepatocitele de șobolan cultivate au fost expuse la 50 uM CBX, 20 uM TAT-Gap24, 20 uM TAT-Gap19 sau la controlul vehiculului timp de 30 de minute, 24 de ore și 48 de ore. Analiza FRAP a fost efectuată așa cum s-a descris anterior 37. Fluorescența în celula albită a fost exprimată ca procentul de recuperare în raport cu nivelul inițial imediat înainte de fotoblanșare. O analiză similară a fost efectuată pe celulele îndepărtate din zona albită pentru a monitoriza fotoblanșarea în afara zonei țintă. Valorile de recuperare pentru fiecare experiment au fost normalizate la condițiile adecvate de control al vehiculului. În plus, valorile Y 0, platoul, tau, jumătate de timp și fracția mobilă au fost calculate după o curbare neliniară.

Măsurarea adenozin trifosfatului extracelular

ATP eliberat extracelular a fost măsurat folosind un kit comercial de testare a luciferinei/luciferazei (Sigma, SUA) așa cum s-a descris anterior 37. TAT-Gap24 și TAT-Gap19 au fost incubate mai întâi la 37 ° C timp de 0 minute, 6 zile sau 20 de zile într-un incubator clasic (Galaxy 170S, New Brunswick, Germania). Culturile de hepatocite primare de șobolan au fost apoi expuse la 20 uM TAT-Gap24, 20 uM TAT-Gap19, 50 uM CBX sau la controlul vehiculului timp de 30 de minute. Aceste experimente au fost efectuate la 24 de ore după izolarea hepatocitelor primare.

Examen histopatologic

Probele de țesut hepatic au fost fixate în formalină 10% tamponată cu fosfat timp de 24 de ore și încorporate în ceară de parafină. Probele au fost în 5. Secțiunile M sunt tăiate și colorate cu hematoxilină-eozină pentru a evalua steatoza, balonarea hepatocelulară, inflamația lobulară și NAS așa cum s-a descris anterior 22. Gradul de steatoză a fost evaluat utilizând următoarea scală în 4 puncte, steatoza de gradul 0, implicând 66% din hepatocite. Inflamația lobulei a fost, de asemenea, evaluată pe o scară de 4 puncte, și anume gradul 0, fără focare; Gradul 1, mai puțin de 2 efective pe câmp × 20; Grad 2, 2 până la 4 efective pe câmp × 20; Gradul 3, mai mult de 4 efective pe câmp × 20. Formarea balonului hepatocitar a fost evaluată pe o scară de 3 puncte: 0, niciuna; 1, unele celule cu balon; 2, orice/celule de balon proeminente. Pentru NAS, caracteristicile steatozei, inflamației lobulare și balonului hepatocitar au fost combinate cu valori de la 0 la 8.

Analiza aminotransaminazelor serice, trigliceridelor serice și hepatice și a colesterolului

Lipidele hepatice au fost extrase cu cloroform/metanol. În special, țesutul hepatic a fost omogenizat în 1 ml de soluție de cloroform/metanol 2: 1 și agitat într-un Thermomixer (Eppendorf, Germania) la 22 ° C timp de 1 oră. Probele au fost centrifugate la 5000 x g timp de 10 minute, după care supernatantul a fost îndepărtat. Apoi, 200 .mu. S-a adăugat L apă distilată și probele au fost centrifugate la 8.000 x g timp de 5 minute. Faza de jos a fost uscată la 37 ° C peste noapte. Înainte de analiză, lipidele au fost dizolvate în 400 pl de butanol (Sigma, SUA). ALT, AST, trigliceride și colesterol au fost măsurate cu un analizor chimic (Labmax 240, Labtest, Brazilia). Rezultatele au fost exprimate în UI/l pentru AST și ALT, mg/dl pentru trigliceridele serice și colesterol și µg/mg pentru trigliceride hepatice și colesterol.

Analiza citokinelor hepatice inflamatorii

Țesutul hepatic a fost omogenizat în tampon de liză cu inhibitori de protează (Roche, Germania). Omogenatele au fost centrifugate la 14.000 x g timp de 15 minute la 4 ° C și concentrațiile de proteine ​​în supernatante au fost determinate prin Metoda Bradford 62 folosind un kit comercial (Bio-Rad, SUA) cu ser albumină bovină ca standard. Kituri ELISA au fost utilizate pentru a măsura nivelurile de IL-1β, IL-6, IL-10, IFN-γ și TNF-α (BD Biosciences, SUA) în ficat 63.

Analiza enzimelor antioxidante hepatice

Analiza întregului transcriptom

Analiza imunoblotului

Analiza imunoblot a țesutului hepatic a fost efectuată așa cum s-a descris anterior 63. Membranele nitrocelulozice/PVDF au fost incubate peste noapte la 4 ° C cu anticorp primar direcționat către Cx26 (diluție 1/1000), Cx32 (diluție 1/1000), Cx43 (diluție 1/1000), CD36 (diluție 1/250), NADPH oxidază (Diluție 1/250) și LY86 (diluție 1/500) (Sigma, Belgia) urmată de incubare timp de 1 oră la temperatura camerei cu anticorp secundar adecvat (diluție 1/1000 pentru Cx26, Cx32 și Cx43; diluție 1/500 pentru CD36, NADPH oxidaza și LY86) (Dako, Danemarca). Analiza densitometrică a fost efectuată utilizând software-ul Image Lab 5.0 (Bio-Rad, SUA). În scopuri de semi-cuantificare, semnalele au fost normalizate în raport cu proteinele totale, măsurate cu geluri fără pete și exprimate ca modificări relative comparativ cu animalele hrănite cu ND.

analize statistice

Numărul de repetări biologice (n) și tehnice (N) pentru fiecare analiză a variat și este specificat în discuția rezultatelor. Toate datele au fost exprimate ca medie ± eroare standard a mediei (SEM). Rezultatele au fost prelucrate statistic prin analiza unidirecțională a varianței cu corecția post hoc Bonferroni. Toate datele au fost prelucrate utilizând software-ul GraphPad Prism6, cu valori de probabilitate (p) mai mici de 0,05 considerate semnificative.

mulțumire

Autorii vor să le mulțumească lui Terra De Win, Tineke Vanhalewyn, Paul Claes și Steven Branson pentru munca lor tehnică dedicată. Această lucrare a fost susținută financiar de subvențiile acordate de Universitatea din São Paulo-Brazilia, Fundația Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (grantul FAPESP SPEC 2013/50420-6 și 2016/16182-9), Consiliul European pentru Cercetare ( ERC Starting Grant 335476), Fondul pentru cercetare științifică-Flandra (FWO acordă G009514N și G010214N) și Spitalul Universitar din Vrije Universiteit Brussel-Belgia („Willy Gepts Fonds” UZ-VUB).

Material electronic suplimentar

Informatii suplimentare

Observații

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord cu termenii noștri de utilizare și cu regulile comunității. Dacă găsiți ceva abuziv sau care nu respectă termenii sau liniile directoare, marcați-l ca fiind inadecvat.