Introducere în tehnicile utilizate; este în biochimie
Un anticorp (Ab) este o proteină produsă de sistemul imunitar care se poate lega de o moleculă specifică, de obicei o proteină, antigenul acesteia (Ag). Specificitatea foarte ridicată a recunoașterii unui Ag de către un Ab și stabilitatea interacțiunii Ag-Ab a făcut ca tehnicile derivate din imunologie să fie exploatate chiar și pentru studii care nu au nimic de-a face cu cercetarea.
Anticorpii sunt proteine din familia imunoglobulinei (Ig). În organism există mai multe tipuri de Ig (IgA, IgG, IgM etc.). În aplicațiile biochimice, folosim în principal IgG, anticorpi care se pot lega la doi antigeni. Mult mai puțin utilizate, dar având un potențial de dezvoltare interesant, IgY sunt produse de păsări, inclusiv de pui, și se găsesc în ouă, eliminând necesitatea de probe de sânge.
Pentru o discuție mai aprofundată a structurii anticorpilor, se poate face referire la un bun manual de imunologie. Este de asemenea disponibilă o prezentare simplă, dar relativ completă a acestor informații, de D. Wilkinson
METODE ȘI APARATE
În prezent, anticorpii sunt obținuți de obicei de la furnizori comerciali. În unele cazuri, trebuie să produceți singuri anticorpii, mai ales dacă lucrați cu proteine rare sau descoperite recent. În primul rând, animalele trebuie imunizate pentru a le face să producă anticorpi împotriva proteinei la care lucrați. Se pot prepara anticorpi policlonali sau monoclonali. Din acest preparat brut este adesea necesar să se procedeze la purificarea anticorpului.
Calitatea unui preparat de anticorp în scopuri de testare sau identificare depinde de doi factori principali, specificitatea și aviditatea (sau afinitatea). În primul rând, anticorpul trebuie să reacționeze numai împotriva proteinei de interes pentru a evita reacțiile încrucișate cu alte proteine susceptibile să o contamineze, aceasta este specificitatea. Pe de altă parte, trebuie să reacționeze puternic cu această proteină și să aibă o mare afinitate pentru ea, este lăcomie.
Imunizarea animalelor
Anumite specii sunt utilizate în special pentru a produce anticorpi: iepuri, șoareci, șobolani, capre, oi și cai. Alegerea animalului se bazează pe diverse criterii. Dacă trebuie să produceți mult antiser, atunci alegeți un animal mai mare. cu toate acestea, animalele mari sunt mai scumpe (cumpărare, reproducere etc.) și sunt adesea mai puțin ușor de manevrat. Pe de altă parte, dacă dorim un animal ușor de manipulat și de crescut în laborator, ne vom îndrepta spre specii mai mici. Animalele mici, cum ar fi șobolanii sau șoarecii, sunt ușor deținute în facilități ieftine și sunt ușor de manevrat. Cu toate acestea, cantități mari de sânge nu pot fi luate. Prin urmare, sunt adesea folosite specii de dimensiuni intermediare, cum ar fi iepurele. Cantitatea de antigen disponibilă este, de asemenea, un factor foarte important: cu cât animalul este mai mare, cu atât este necesar mai mult antigen pentru a induce un răspuns imun util.
Oricum ar fi, este important să alegeți un animal care să fie filogenetic cât mai departe posibil de sursa proteinei cu care doriți să vă imunizați. Într-adevăr, o proteină este cu atât mai antigenică cu cât nu seamănă cu o proteină prezentă în mod normal în specia pe care se dorește să o imunizeze. Astfel, dacă cineva dorește să pregătească un anticorp împotriva unei proteine de șobolan, se preferă deseori să se imunizeze un cal sau o capră decât un alt rozător, cum ar fi un șoarece. După cum sa menționat anterior, totuși, limitările inerente utilizării animalelor mari pot încuraja în continuare trecerea la o specie mai puțin adecvată, care este mai ușor de reproducere și de manipulat. Este, de asemenea, evident că nu se poate imuniza un animal împotriva unei proteine comune animalelor din propria specie! Șoarecii sunt utilizați în special pentru producerea de anticorpi monoclonali.
Antigenul poate fi injectat în mai multe moduri, important este că antigenul rămâne în organism cât mai mult posibil și intră în fluxul sanguin încetul cu încetul pentru a maximiza producția de anticorpi. Principalele căi de administrare sunt injecțiile subcutanate, intradermice sau intramusculare; injecțiile intravenoase și intraperitoneale sunt utilizate numai în cazuri speciale. Pentru a încetini eliberarea antigenului în sânge și pentru a activa răspunsul imun, antigenul este de obicei combinat cu o emulsie numită adjuvant. Cel mai cunoscut este, fără îndoială, adjuvantul lui Freund, care este compus din ulei mineral cu adăugarea unui agent emulsionant (adjuvant incomplet) și a particulelor de bacil inactivat al tuberculozei (adjuvant complet). Cu toate acestea, acest tip de procedură adjuvantă pentru comlet este dureroasă pentru animale și este puternic descurajată de agențiile de bunăstare a animalelor. Alte produse sunt mai rar folosite, cum ar fi sărurile de alum, serul albuminat de carne metilat etc.
Sistemul imunitar produce relativ ușor anticorpi împotriva moleculelor mari, cum ar fi proteinele și polizaharidele, aceste molecule sunt numite imunogeni. Cu toate acestea, moleculele mici (de exemplu, hormoni steroizi, peptide mici etc.) au o antigenicitate foarte mică. Cu toate acestea, anticorpii pot fi produși împotriva moleculelor mici care sunt numite apoi „haptene”. În primul rând este necesar să conjugați aceste molecule mici pe vectori („purtători”), proteine precum albumina sau hemocianina limpet (un fel de nevertebrat). Acest complex, odată injectat în animal, va induce formarea de anticorpi împotriva haptenului ca atare și a vectorului. După ce au eliberat anticorpii împotriva haptenei proprii celor care recunosc vectorul, acești anti-hapteni pot fi utilizați. Astfel putem prepara anticorpi împotriva anumitor hormoni, medicamente sau peptide mici.
Serul care conține anticorpul dorit se numește antiser. Conține în mod normal mai multe specii de anticorpi diferiți (aproximativ zece clonotipuri) îndreptate împotriva mai multor epitopi (determinanți sau situri de legare) ale aceluiași antigen, acest preparat policlonal este numit. Cu un astfel de amestec, aceeași moleculă de antigen poate lega mai mulți anticorpi diferiți în același timp, fiecare cu epitopul său specific. S-au dezvoltat tehnici pentru izolarea și clonarea limfocitelor care produc o singură specie moleculară (adică clonotipul) de anticorpi, acești anticorpi sunt numiți monoclonali. Acești anticorpi recunosc doar un singur epitop al antigenului.