Măsurarea duratei de viață în protocolul Drosophila melanogaster (tradus în germană)

rezumat

Drosophila melanogaster este un model puternic pentru explorarea bazelor moleculare ale reglării longevității. Acest protocol va discuta pașii implicați în generarea unei măsurări reproductibile, bazate pe populație, a duratei de viață, precum și posibilele capcane și cum să le evitați.

Abstract

Îmbătrânirea este un fenomen care are ca rezultat deteriorarea fiziologică staționară în aproape toate organismele în care a fost studiată, rezultând o performanță fizică scăzută și un risc crescut de boală. Îmbătrânirea individuală se manifestă la nivel de populație ca o creștere a mortalității legate de vârstă, care este adesea măsurată în laborator prin observarea duratei de viață în cohorte mari de oameni de aceeași vârstă. Experimentele pentru a încerca să cuantifice măsura în care manipulările genetice sau de mediu afectează durata de viață a organismelor model simple au avut un succes remarcabil pentru înțelegerea aspectelor legate de îmbătrânire care sunt relevante pentru taxoni și pentru a inspira noi strategii pentru extinderea duratei de viață și prevenirea bolilor legate de vârstă la mamifere sunt păstrate .

Protocol

Vă recomandăm să păstrați alimente experimentale, pastă de drojdie și plăci de agar de struguri, care apar în protocol la 4 ° C și să le utilizați în decurs de 1-2 luni, atâta timp cât nu sunt stabilite forma și uscăciunea. Condițiile de mediu standard atât pentru larve cât și pentru stadiul adult includ menținerea Zboară într-un incubator la 25 ° C cu un ciclu de lumină-întuneric 12:12 h și umiditate relativă de 60%.

A. Pregătirea pentru gătirea experimentală

Pentru creșterea larvelor, folosim un Caltech Medium 5 modificat, care este abreviat ca CT în acest protocol.
Vă recomandăm o dietă pentru Drosophila pentru adulți (SY) care constă din zahăr (zaharoză) și drojdie (drojdie de bere întreagă liofilizată) într-o bază de 2% agar care a fost fiartă, suplimentată cu antibiotice și agenți antifungici și dispersată (10 ml per flacon) 6. Alimentele trebuie lăsate să se solidifice și să se evapore timp de 12-24 ore înainte de depozitare. Deoarece mediul nutritiv poate influența în mod substanțial longevitatea, metodele de gătit consistente sunt esențiale atât în cadrul unui experiment, cât și pentru comparație între experimente.
Dacă trebuie adăugat un agent farmacologic la alimentele pentru adulți, acest medicament poate fi amestecat într-un lot mic de alimente și stratificat (2 ml) pe suprafața alimentelor cu flacoane de control care conțin straturi de vehicul.

2. Pregătiți o pastă de drojdie vie

Combinați 5-6 ml de apă cu 3 g de drojdie uscată și amestecați bine. Consistența pastei de drojdie trebuie să fie aceea pentru untul de arahide neted.

3. Pregătiți o placă de agar de struguri

Adăugați un pachet de premix agar de struguri la 500 ml apă distilată într-o sticlă de 1.000 ml și urmați instrucțiunile de pe ambalaj pentru a dizolva amestecul de agar de struguri.
Se toarnă cu grijă un strat gros al amestecului în cutii Petri de 100 mm evitând barbotarea. Un pachet de Premix produce aproximativ 14 plăci de agar de struguri.
Lăsați mediul să se răcească și să se solidifice la temperatura camerei cu capacul aprins timp de 15 min. Plăcile pot fi depozitate la 4 ° C, învelite în folie de plastic sau utilizate imediat.

4. Colecția de ouă sincronizate

Toate mediile utilizate în acest protocol, adică drojdie, plăci de agar de struguri, CT și alimente 10% SY, ar trebui să fie la temperatura camerei.

5. Colecția de muște adulte potrivite vârstei

Adulții vor ecloza de obicei 9 începând cu prima zi. Aruncați muștele care au apărut în prima zi și puneți sticlele înapoi în incubator peste noapte. Această practică va evita selecțiile accidentale pentru aparițiile inițiale și pentru colectarea unui număr maxim de muște sincronizate.
16-22 de ore mai târziu, un adult în vârstă de o zi zboară în sticle de alimente cu 10% SY. Dacă este necesar, a doua zi poate fi colectat un alt lot.
Zboară înapoi în incubator și permite muștelor să atingă maturitatea sexuală și să se împerecheze timp de două zile. Notați ziua transferului pe sticle de 10% SY ca prima zi de maturitate.

6. Sortarea muștelor și configurarea experimentului de longevitate

Anesteziați grupuri mici de muște pe tamponul anestezic, apoi sortați bărbații și femeile în două grupuri cu o perie. Atunci când se utilizează CO 2, este esențial să se minimizeze expunerea la posibile probleme de sănătate pe termen lung care pot compromite integritatea experimentului de longevitate.
Plasați 30 de muște de același sex în fiole individuale. Presupunând că nu există cromozomi echilibrați în populație și descendenți sănătoși, fiecare sticlă ar trebui să producă aproximativ 3-4 fiole din fiecare sex. Alicotarea muștelor în flacoane individuale nu trebuie să depășească 3-4 minute, astfel încât muștele să fie expuse anesteziei numai timp de maximum 9-10 minute.
Repetați pașii până la 6.1-6.2 există 8-10 repetări flacoane pentru fiecare sex și terapie experimentală.

7. Configurați foaia de calcul Excel pentru a urmări experimentul de longevitate

Recomandăm randomizarea poziției flaconului mai degrabă decât gruparea flacoanelor în funcție de starea experimentală, pentru a evita înclinarea în poziția flaconului în incubator și pentru a ascunde identitatea flaconului experimentatorului. Pentru a face acest lucru, atribuiți mai întâi un ID numeric randomizat fiecărei fiole dintr-un program de calcul tabelar, apoi aranjați fiolele în tăvi după numărul de identificare. Dacă utilizați software-ul de gestionare a experimentului dLife, urmați instrucțiunile de configurare a experimentului pentru a genera numărul de identificare pentru fiecare fiolă.
(Opțional) Dacă utilizați un cititor RFID sau un cititor de coduri de bare în colaborare cu dLife, atașați o etichetă RFID sau cod de bare la fiecare fiolă și asociați eticheta cu fiola cu ID-ul numeric din dLife. Programul recunoaște fiecare flacon atunci când este scanat cu un cititor și începe să înregistreze datele în locul corect într-un tabel. Utilizarea unui cititor de etichete împreună cu dLife reduce timpul de achiziție a datelor și erorile de înregistrare.

8. Menținerea experimentului de longevitate

Fiolele cu alimente proaspete trebuie să fie la temperatura camerei pentru fiecare transfer.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

O schemă simplificată a protocolului se află în ilustrația 1, unde sunt conturați pași importanți. Partea de sincronizare a protocolului poate necesita muște adulte ajustate în funcție de vârstă pentru diferite teste.

Curbele tipice ale ratei de supraviețuire a muștelor de tip sălbatic sunt prezentate în Figura 2a afișat folosind software-ul de gestionare a experimentului dLife (Fig. 2b, c). Bărbații adulți trăiesc în cea mai mare parte o viață mai scurtă, ambele populații ating o longevitate medie și medie> 50 de zile pe un aliment de 10% SY la 25 ° C. Rețineți că supraviețuitorul rămâne ridicat în prima parte a experimentului și apoi cade exponențial.

Durata de viață a Drosophila este influențată de condițiile de mediu, cum ar fi temperatura și dieta. Figura 3a arată că bărbații adulți trăiesc în mod semnificativ mai puțin pe măsură ce temperatura crește. La fel, efectul dietei va fi pe tot parcursul vieții în 3b cadouri: Femelele adulte zboară după o dietă mai puțin concentrată (5% SY) trăiesc de obicei semnificativ mai mult decât cele cu o dietă mai concentrată (15% SY).

Densitatea cohortelor în timpul dezvoltării poate afecta durata de viață a adulților și poate modifica timpul de dezvoltare. Aici vom arăta un exemplu al modului în care diferite densități ale ouălor sincronizate afectează dezvoltarea larvelor. La fel de în 4 prezentat, randamentul muștelor adulte este slab și suprafața alimentelor este predispusă la uscare atunci când numărul de ouă este prea mic. La celălalt capăt al spectrului, dezvoltarea larvelor este întârziată în sticlele supraumplute și randamentul muștelor adulte este redus.

Curba de supraviețuire a cohortei în ansamblu poate fi influențată semnificativ de efectele anormale ale fiolei, ca în Figura 5 afișate. Datele de supraviețuire neregulate pentru fiolele individuale pot avea mai multe cauze, precum calitatea slabă a alimentelor sau acumularea și infecția de bacterii/ciuperci. În timp ce astfel de decese anormale nu pot distorsiona măsura de supraviețuire a populației, nu există o metodă simplă pentru a determina în mod adecvat că un flacon ar trebui exclus din experiment. Prin urmare, aceste situații sunt cel mai bine evitate printr-o bună manipulare și atenuate prin utilizarea unei dimensiuni mari a eșantionului.

ilustrația 1. Reprezentare schematică simplificată a unui test de viață Drosophila.

Figura 2. (A) Curbele reprezentative ale duratei de viață 1118 controlează femela (cercurile) și masculul (pătratele) zboară la 25 ° C pe un aliment SY10%. (B, C) Capturi de ecran reprezentative ale software-ului dLife.

Figura 3. Efectele temperaturii (A) și ale furajelor (B) asupra duratei de viață a adulților. A. Muștele masculine de control al adulților (Canton S) au fost menținute la 18 ° C până la vârsta adultă, 25 ° C sau 29 ° CB Controlul adulților (w 1118) muștele femele au fost hrănite fie cu o dietă SY SY de 15%, fie cu 5%.

Figura 4. Ziua 9 de dezvoltare (la 25 ° C) a ouălor sincronizate, alicotate în sticle de mâncare CT. Volumul alicotei care conține embrion este indicat ca sub fiecare sticlă.

Figura 5. Graficul reprezentativ din software-ul dLife arată rata de supraviețuire a fiolei. Săgeata arată un singur flacon anormal într-un grup.

Figura 6. Exemple de calitate suboptimală a alimentelor. A. Blistere la suprafața industriei alimentare. B. Hrana micșorată de la marginea flaconului. C. fisuri în alimente. D. Acumularea de bacterii la suprafața alimentelor.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

Protocolul prezentat aici descrie o metodă de efectuare a măsurătorilor reproductibile ale longevității adulților în Drosophila, care este adaptabilă la evaluarea intervențiilor genetice, farmacologice și de mediu. Aspectele centrale ale protocolului includ controlul atent al mediului de dezvoltare larvelor, minimizarea stresului adulților și minimizarea prejudecății asupra grupurilor experimentale și a controalelor. De asemenea, introducem utilizarea software-ului de gestionare a experimentelor dLife. Prin simpla atașare a unui cod de bare sau a unei etichete RFID la fiecare navă, programul va ajuta la achiziționarea datelor dLife pentru fiecare măsurare și la trasarea curbei ratei de supraviețuire. Deși este în prezent cel mai potrivit pentru studierea duratei de viață a muștelor folosind flacoane, acest instrument de gestionare a experimentului ar putea fi ușor adaptat pentru utilizare în alte organisme, cu diferite tipuri de camere de populație, sau pentru măsuri suplimentare, inclusiv rezistența la stres și supraviețuirea Toxicitatea medicamentelor.

Aspectele importante ale controlului mediului larvel/pupă includ evitarea supraaglomerării și menținerea unui mediu controlat cu o reglementare strictă a perioadelor de lumină-întuneric, umiditate și temperatură. Acești factori afectează atât dezvoltarea temporală, cât și calitatea fizică a adulților rezultați. Mediile larvare nedorite, cum ar fi densitatea larvelor ridicate, pot duce la activarea factorilor inducibili de stres (de exemplu, expresia proteinei șocului termic) despre care se știe că afectează longevitatea adulților 18.

Au fost propuse abordări alternative de hrănire a analizei duratei de viață, incluzând o abordare de alimentare capilară (metoda CAFE) 23. Această metodă se remarcă prin capacitatea sa de a oferi măsurători precise ale consumului de alimente, dar conduce la muște cu o durată de viață semnificativ mai mare 24. Posibilele tensiuni asociate mediului de hrănire trebuie utilizate în evaluarea relației combinate dintre dietă și factorii genetici în longevitatea generală voi.

Analiza demografică, inclusiv calculul curbelor de supraviețuire și mortalitate, poate dezvălui multe informații despre dinamica îmbătrânirii populației. O curbă tipică de supraviețuire va rămâne relativ plană pentru o perioadă extinsă la începutul vieții și va crește rata declinului la femeile în vârstă, ceea ce corespunde unei perioade de mortalitate scăzută, urmată de o perioadă de creștere exponențială a mortalității. Un mediu stresant se va manifesta de obicei ca un exces de decese premature la populație și o scădere anormală a curbei de supraviețuire. Deși un astfel de rezultat poate da diferențe semnificative între tratamente, de obicei nu va fi robust la replicare. Prin urmare, recomandăm ca cel puțin două experimente replicate independente (adică non-tranzitorii) să fie efectuate înainte de a putea trage o concluzie fermă. Pot fi necesare eforturi suplimentare pentru creșterea dimensiunii eșantionului, controlul condițiilor de adăpostire și îmbunătățirea stării de sănătate a plantelor-mamă.

Cenzura de dreapta (scoaterea animalelor din experiment despre care se suspectează că a scăpat sau a murit din cauze aleatorii) a animalelor care mor din cauza condițiilor de mediu stresante ar trebui aplicată cu precauție extremă. Strict vorbind, dispozitivul de cenzură trebuie să apară în mod aleatoriu peste tratamentele experimentale și, dacă intervenția experimentală modulează sensibilitatea la stres, s-ar putea aplica, în mod accidental, selecții la nivel de tratament pentru populație. Ca regulă generală, evitarea prezenței unor factori ambigui care pot provoca moartea timpurie (în special asociate cu sursa de hrană) este mai bună decât dispozitivul de cenzurare și dispozitivul de cenzurare trebuie aplicat doar organismelor observate că mor sau scapă în timpul manipulării fizice.

O ultimă considerație este evaluarea semnificației statistice. În timp ce dimensiunile mari ale eșantioanelor de cohortă oferă performanțe impresionante în distingerea diferențelor mici între tratamente, trebuie luată în considerare și semnificația biologică potențială a acestei diferențe. Cu experimente de longevitate destul de mari, diferențele sunt adesea la un nivel semnificativ statistic de 2,1%, dar impactul general al intervenției asupra stării de sănătate poate fi mic. Prin urmare, trebuie acordată importanță atât statistică, cât și biologică în interpretarea rezultatelor generale ale experimentului. Inferența despre procesul de îmbătrânire din experimentele de supraviețuire poate fi completată de măsuri de scădere legată de vârstă a măsurilor de sănătate comportamentală sau fiziologică, inclusiv capacitatea de urcare 25 și integritatea peretelui gastro-intestinal.

În concluzie, organismul model Drosophila este o alegere atrăgătoare pentru studierea mecanismelor de îmbătrânire. Cu o tehnică experimentală atentă, o analiză demografică robustă poate oferi o perspectivă asupra efectelor factorilor farmacologici și genetici asupra procesului de îmbătrânire.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.