Microhemoragii cerebrale sub-acute induse de injecția lipopolizaharidică la protocolul șobolanilor

rezumat

Prezentăm un protocol pentru inducerea și detectarea MHC induse de injecția LPS la șobolanii Sprague-Dawley, care pot fi utilizate în cercetările viitoare privind patogeneza MHC.

Abstract

Microhemoragiile cerebrale (CMH) sunt frecvente la pacienții vârstnici și sunt corelate cu diverse tulburări neuropsihiatrice. Etiologia MHC este complexă și neuroinflamarea este adesea văzută ca o coincidență. Aici descriem un model subacut MHC de șobolani indus prin injecția de lipopolizaharidă (LPS), precum și o metodă de detectare a injecției sistemice de LPS MHC. este relativ simplu, economic și rentabil. Un avantaj major al injectării LPS este stabilitatea sa de a induce inflamația. MHC-urile induse prin injecția LPS ar putea fi detectate prin observare grosieră, colorare hematoxilină și eozină (HE), colorare prussiană Perl, colorare Evans albastră dublă (EB) și tehnologie de imagistică a senzitivității prin rezonanță magnetică (MRI-SWI). În cele din urmă, alte metode de dezvoltare a modelelor animale CMH, inclusiv avantajele sau dezavantajele acestora, sunt, de asemenea, discutate în acest raport.

Introducere

Microhemoragii cerebrale clasice (MHC) Vezi depozite mici perivasculare de produse de descompunere a sângelui precum hemosiderina din celulele roșii din sânge în creier 1. Conform studiului Rotterdam Scan, CMH-urile au fost găsite la aproape 17,8% dintre persoanele cu vârsta cuprinsă între 60 și 69 de ani și 38,3% la cei peste 80 de ani 2. Prevalența MHC la vârstnici este relativ ridicată și a fost stabilită o corelație între acumularea MHC și disfuncția cognitivă și neuropsihiatrică 3, 4. S-au raportat recent mai multe modele animale de MHC, inclusiv modele de rozătoare induse de injecția de colagenază stereotaxică de tip IV 5, APP transgenice 6, expunerea la β-N-metilamino-L-alanină, 7 și 8 de hipertensiune arterială, cu MHC induse de inflamația sistemică ca una dintre alegerile mai recunoscute. Fisher și colab. 9 au folosit mai întâi LPS derivat din Salmonella typhimurium pentru a dezvolta un model acut de șoarece MHC. Ulterior, același grup a raportat dezvoltarea unui model de șoarece MHC subacut folosind aceeași abordare 2 .

LPS este considerat a fi un stimul inflamator standardizat prin injecție intraperitoneală. Studiile anterioare au confirmat că injecția cu LPS ar putea provoca neuroinflamare, reflectată de cantitățile mari de celule microgliene și activarea astrocitelor la animalele model 2, 10. În plus, a fost stabilită o corelație pozitivă între activarea activării neuroinflamării și numărul de MHC2, 10. Pe baza acestor studii anterioare, am fost invitați să dezvoltăm un model de MHC de șobolan prin injecție intraperitoneală de LPS.

Progresele în tehnologiile de detectare au dus la o creștere a numărului de căutări pe MHC. Cele mai recunoscute metode de detectare a MHC includ detectarea celulelor roșii din sânge prin colorarea hematoxilinei și eozinei (HE), detectarea fierului feric din colorarea albastru prusian 9, detectarea depozitelor de albastru Evans prin imagistica imunofluorescentă (EB). Și imagistica prin rezonanță magnetică Tesla 7.0 -Imagistica ponderată pentru sensibilitate (IRM-SWI) 10. Prezentul studiu își propune să dezvolte o metodă de screening pentru MHC.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Toate metodele descrise aici au fost aprobate de către Spitalul General al Armatei PLA și Comitetul pentru Utilizarea Animalelor (ACUC).

1. materiale

  1. Pregătirea pentru injecția LPS
    1. Se adaugă 25 ml apă distilată la 25 mg pulbere LPS derivată din Salmonella typhimurium, la o concentrație finală de 1 mg/ml. Păstrați injecția într-un tub steril la 4 ° C.
      ATENȚIE: LPS este toxic.
    2. Pregătiți o soluție de 2% EB în soluție salină normală 0,9% pentru a menține o injecție EB la concentrația de lucru.

  1. Administrați LPS la șobolani Sprague-Dawley (SD) masculi în vârstă de 10 săptămâni (greutate medie: 280 ± 20 g) prin injecție intraperitoneală.
    ATENȚIE: Dacă șobolanii sunt cumpărați de la o altă organizație, atunci faza de adaptare nu trebuie să fie mai mică de 7 zile.

3. Injecții LPS

  1. Injectați LPS intraperitoneal toți șobolanii la o doză de 1 mg/kg și readuceți șobolanii în cușca lor de acasă.
    Notă: Anestezia nu este necesară.
  2. Șase ore mai târziu, injectați aceeași doză de injecție de LPS la șobolani.
  3. Șaisprezece ore mai târziu injectați aceeași doză de LPS șobolanilor.
    ATENȚIE: Injecția șobolanilor SD cu LPS la o doză de 1 mg/kg poate duce la o rată a mortalității de 5%. Rata mortalității ar putea crește în continuare la șobolanii mai tineri sau mai în vârstă sau la șobolanii gravide.
  4. Întoarceți șobolanii în cuștile lor după injectarea LPS și oferiți acces la alimente și băuturi ad libitum .
    NOTĂ: Șobolanii vor prezenta un răspuns inflamator sistemic distinct și, prin urmare, este esențial ca cuștile să rămână curate pe tot parcursul experimentului. Șobolanul trebuie monitorizat frecvent (2 ori pe zi) pentru greutate, aspect general și atitudine după prima injecție cu LPS. Dacă șobolanii încep să prezinte o postură încordată, reticența în a se mișca, pierderea semnificativă în greutate (> 20%), colorarea porfirinei au fost eutanasiați uman înainte de ziua 7 a studiului final al EB.

4. proba

5. are colorare

Notă: Această procedură se efectuează folosind un kit de colorare a ochilor.

  1. Spălați lamele în apă distilată.
  2. Se colorează în soluția de hematoxilină timp de 8 min. se spală în apă curentă timp de 5 min.
  3. Diferențiați în alcool acid 1% timp de 30 de secunde. se spală în apă curentă 1 min.
  4. Detergent de pete la 0,2% apă amoniacală (albire) sau soluție saturată de carbonat de litiu timp de 30 s până la 1 min. se spală în apă curentă timp de 5 min.
  5. Clătiți cu alcool 95% (10 picături).
  6. Contrastează cu soluție de eozină timp de 30 s până la 1 min.
  7. Deshidratați cu 95% alcool, două modificări de alcool absolut, câte 5 minute fiecare.
  8. Se curăță în xilen timp de 30 de secunde.
  9. Urcați folosind metoda lui Liu 9 .
  10. Analizați folosind un microscop cu fluorescență în câmp luminos.
    NOTĂ: celulele roșii din sânge, eliberate de vasele de sânge, care constituie componentele MHC, sunt prezentate în colorare roșu-portocalie sub.