O nouă metodă de clarificare pentru a vizualiza degenerarea biliară în timpul metamorfozei hepatice în mare
rezumat
Lamproia de mare pierde vezica biliară și căile biliare în timpul metamorfozei, un proces similar cu atrezia biliară umană. O nouă metodă de fixare și clarificare (CLARITY) a fost modificată pentru a vizualiza întregul arbore biliar folosind microscopia confocală cu scanare laser. Această metodă oferă un instrument puternic pentru studierea degenerescenței biliare.
Abstract
Introducere
Lamprea de mare se dezvoltă prin trei etape de viață distincte 1,2. Larvele de lamprea (L) petrec mai mult timp în vizuini ca filtratoare bentonice. După parcurgerea a șapte etape metamorfice de schimbări dramatice în morfologia externă și reorganizarea organelor interne 3, puietii rezultați (JV) intră într-o etapă parazitară în timpul căreia se hrănesc cu sângele și fluidele tisulare ale peștelui gazdă, creșterea masei corporale a de peste 100 de ori. După 1,0 până la 1,5 ani de hrănire cu peștii gazdă din ocean sau lacuri mari, adulții încetează să se hrănească la începutul primăverii și migrează în râuri pentru a genera și muri 1,2.
În timpul metamorfozei, ficatul de lamprea de mare pierde vezica biliară și întregul arbore biliar, un fenotip mutant evolutiv care imită boala copilăriei umane a atreziei căilor biliare. Atrezia biliară infantilă este o afecțiune hepatică pediatrică rară, cu complicații medicale grave 4,5,6,7,8,9,10, dar patogeneza și etiologia atreziei căilor biliare este în mare parte necunoscută 4. Pacienții cu atrezie biliară mor în decurs de doi ani după naștere, cu excepția cazului în care se efectuează o intervenție chirurgicală (procedura Kasai) 5. Ulterior, acești pacienți necesită un control clinic extins și deseori un transplant de ficat 6. Au fost propuse multe teorii ale atreziei biliare etiopatogeneza, cum ar fi infecția virală, defectul congenital, boala autoimună și insultă. Cu toate acestea, contribuția fiecăruia la dezvoltarea atreziei biliare rămâne neconcludentă 7,8,9,10.
Spre deosebire de sugarii care suferă de atrezie a căilor biliare, lamprea de mare suferă o dezvoltare programată a atreziei căilor biliare fără necroinflamare extinsă, fibroză sau ciroză 10. Animalele pot experimenta colestază tranzitorie în timpul acestui proces 10, dar se adaptează la această afecțiune. și secreția sărurilor biliare în intestin după atrezia biliară de dezvoltare, pe lângă mecanismele cunoscute, cum ar fi sinteza redusă a sărurilor biliare în ficat 11. Acest proces de dezvoltare în lamprea mare de mare oferă singura oportunitate cunoscută de a examina progresia atreziei biliare.
O metodă recent dezvoltată numită „claritate” permite imagistica de înaltă rezoluție în sistemele nervoase complexe ale mamiferelor prin transformarea țesutului intact într-un hidrogel nanoporos transparent 12. Folosind ficatul de lamprea de mare și un protocol CLARITY modificat, imagistica tisulară a degenerescenței biliare intacte poate fi documentată în întregul ficat. metamorfoză.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Protocol
A. Soluție de pregătire
2. Pregătirea țesuturilor
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Rezultate reprezentative
Mai multe evenimente importante au loc în dezvoltarea sistemului hepatobiliar în timpul metamorfozei lamprii de mare. Canalul biliar și vezica biliară și suferă apoptoză degenerată (Figura 1). Combinarea metodei de clarificare modificată și marker de colorare a ficatului de 19 celule de citokeratină (CK19, prezentă atât în colangiocite și hepatocite înainte și după metamorfoză 13), cât și marker anti-apoptotic Bcl2 utilizând microscopie confocală, setul sistemului biliar a fost capturat de-a lungul axa Z ( figura 2) iar structura tridimensională a fost reconstruită (figura 3). Microscopia cu scanare laser confocală a fost utilizată pentru a efectua secțiunea optică prin ficatul intact, deoarece cea mai mare parte a sistemului biliar este încorporat în ficat, cu excepția joncțiunii în care conducta biliară intră în intestin. Procesul degenerativ are loc în etapele metamorfice 2-4, de la căile biliare mici periferice la canalele biliare comune sistemice intrahepale mari (figura 2), în conformitate cu studiile anterioare 10.