Optimizarea eficienței endoteliale de diferențiere a celulelor stem CD133 umane pozitive -

1 Din Clinica Medicală și Policlinica II a Centrului Oncologic al Centrului Medical Universitar Hamburg-Eppendorf Optimizarea eficienței diferențierii endoteliale a celulelor stem CD133 umane pozitive Disertație pentru obținerea titlului de doctor în medicină în secția medicală a Universității din Hamburg prezentată de Estelle Jiongo din Camerun Hamburg 2008

diferențiere

2 2 Acceptat de Facultatea de Medicină a Universității din Hamburg pe: Tipărit cu aprobarea Facultății de Medicină a Colegiului de examinare al Universității din Hamburg, președintele: Colegiul de examinare, al 2-lea examinator: Comitetul de examinare, al 3-lea recenzor: Prof. Dr. W. Fiedler Prof. Dr. H. Kabisch Prof. Dr. N. Kroeger

4 4 H RECUNOAȘTERE I DECLARAȚIE FEDERALĂ J LISTA CIFRELOR K LISTA ABREVIERILOR LISTA TABELELOR

23 23 afectate de celulele stem hematopoietice. În acest scop, unele dintre celule ar trebui să fie placate pe soluri care conțin sticlă. O altă posibilitate de creștere a ratei de diferențiere a celulelor stem hematopoietice ar putea fi realizată prin diferențierea celulelor nediferențiate morfologic conținute în supernatanții mediului. La întrebarea dacă celulele neaderente s-ar diferenția endotelial ar trebui să se răspundă prin înlocuirea acestor celule. Alte surse de celule endoteliale sunt celulele stem CD14 pozitive, monocitice (Fernandez și colab., 2000) și MNC (Murasawa și colab., 2002). Acestea ar trebui izolate de leucafereză, de învelișuri tamponate și de măduva osoasă. Investigațiile ar trebui să se limiteze la cuantificarea celulelor endoteliale rezultate și la caracterizarea lor imunohistochimică. Toate cele trei tipuri de celule și celulele stem hematopoietice proaspăt izolate ar trebui comparate între ele în ceea ce privește comportamentul lor de diferențiere.

24 24 C Material și metode 1 Material 1.1 Echipamente de laborator Tab. 1: Echipamente de laborator utilizate Sursa de aprovizionare Denumirea producătorului Echipament Marcă, camera de numărare Wertheim Neubauer Camera de numărare Eppendorf, Hamburg Referință 10, 100 și 1000 pipete Forma Scientific, Marietta (SUA) Incubator cu manta de apă Tehnologie de laborator pentru baie de apă GFL, Burgwedel Heraeus Instruments, Hanau Lamin Air HB 2448 Varifuge 3.2 RS centrifugă sterilă pentru banc de lucru Echipament de laborator Hirschmann, baterie Pipetus, ajutor pentru pipetare Heilbronn Leica, Solms LEICA DM IRB cu software de fluorescență IM50 Microscop inversor Miltenyi Biotec, dispozitiv de separare Bergisch Gladbach, Citocentrifuga Frankfurt Cytospin 2 Zeiss, Jena Axioplan Axiovert 25 Phomi 3 microscop inversat cu fluorescență microscop inversat/microscop cu fluorescență microscop inversat

25 Consumabile Tabelul 2: Consumabile Sursa de aprovizionare Becton Dickinson, Franklin Consumabile Discardit II Seringi sterile; 5, 10 și 20 ml Lakes (SUA) BD Falcon, pipete de unică folosință sterile Heidelberg; 1, 2, 5, 10 și 25 ml plăci de godeuri de cultură celulară; Ciururi cu celule cu 6, 12, 24 sau 96 godeuri cu tuburi de centrifugă de 40 um; 15 și 50 ml Greiner, Frickenhausen Eppendorf, Hamburg Heinz Herenz, Hamburg Millipore, Schwalbach Miltenyi Biotec, Tuburi Bergisch: vase de reacție de 15 și 50 ml; Pipete Pasteur de 0,5 și 1,5 și 2,0 ml 230 mm, sticlă Steriflip (unitate de sterilizare de unică folosință) MACS Coloane de separare LS și MS Gladbach Partec, Münster Paul Marienfeld GmbH & sitele de celule de 30 µm acoperă pahare Co.KG, Königshofen Lauda slide Sarstedt, Vârfuri pentru pipetă Nümbrecht (10, 100 și 1000 µl) Schott, Mainz Shandon Inc., Pittsburgh (SUA) Filtre pentru hârtie pentru sticlă pentru Cytospin 2 (Filtru grosime) VWR International, Filtre sterile pentru seringi 0,45 și 0,22 µm (Dietikon steril) (Elveția) filtru seringă)

26 Produse chimice și produse medicale Tab. 3: Produse chimice și produse medicale utilizate Sursă de aprovizionare Baxter, München Biochrom AG, Berlin Biotest, Dreieich Produs chimic/medical ACD-A Soluție de separare a biocollului (Ficoll) AB-Serum Human Serum Albumin (HSA) Cambrex, New Jersey (SUA) EGM-2 Bullet Kit Fährhaus Handelsgesellschaft Hamburg Gibco, Karlsruhe Pharma mbh, Hydrocortison (HC) D-PBS Fetal Calf Serum (FKS) Fungizone (Amfotericină B) Ser de cal (HS) IMDM Penicilină-Streptomicină-Glutamină (100x) ) Harbour Bio-Products, Fibronectin uman (FN) Norwood (SUA) JT Baker, Phillipsburg Ethanol Absolute (SUA) Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach CD133 Kit de izolare celulară, CD14 umane Micro Beads, umane MACS BSA Stock Solution R&D Systems, Minneapolis (SUA) rhang-1 (Recombinant Human Angiopoietin-1) rhang-2 (Recombinant Angiopoietină umană-2) Soluție albastră Trypan (0,4%) TEBU, Offenbach bfgf (Fibroblast Growth Factor-basic) EGF (Epidermal Growth Factor) Flt-3-Ligand (Flt-3-l, Fms-related tyrosine-kinase 3 ligand)

27 27 HGF (Factor de creștere a hepatocitelor umane) IGF-1 (Factor de creștere asemănător insulinei) IL-8 (Interleukin-8 sau factor chemotactic neutrofil derivat din monocite) SCF (Factor de celule stem) SCGF-ß (Factor de creștere a celulelor stem -beta) VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor or Recombinat Human VEGF165) 1.4 Anticorpi pentru analizele imunofluorescenței Tab. 4: Anticorpi utilizați Marcare umană Isotip Clonă Aplicație Sursă de aprovizionare Antigen g CD144 - Șoarece 55-7H1 Imun- BD Pharmingen, (VE- IgG 1 κ histochimie San Diego (SUA) Cadherin) FITC vwf (von- Sheep- - Immun- The Binding Site, Willebrand Anti- histochemistry Birmingham -factor) Human (UK) IgG Secondary Texas Red Goat- - Immun- Jackson Anticorpi Anti-histochimie ImmunoResearch, pentru CD144 Mouse West Grove IgG (SUA) (H + L)

28 Compoziția tampoanelor și mediului Citokinele utilizate și concentrațiile acestora Tab. 5: Prezentare generală a factorilor utilizați și a concentrațiilor acestora Factori Concentrația în soluția stoc obținută (µg/ml) (ng/ml) bfgf 50 1 EGF Flt-3-l HGF IGF IL rhang-1 (Ang-1) rhang-2 (Ang-2) SCF SCGF-ß VEGF concentrație mediu de bază și tampoane AB-PBS -8 ml PBS -2 ml AB-Ser Erylyse Buffer (steril filtrat) -8,29 g NH4Cl (155 mm) -1g KHCO3 (10 mm) -45,2 mg EDTA (0,1mM) -1L H20 EBM ml EGM-2 mediu bazal -10 ml FCS -1mL penicilină/streptomicină (Pen/Strep) -100 µl amfotericină B.

29 29 EBM-1-80 ml EGM-2 mediu bazal -20 ml FCS -1mL penicilină/streptomicină (Pen/Strep) -100 µl amfotericină B EBM-2-450mL EGM-2 mediu bazal -50 ml FCS -5 ml penicilină/streptomicină -2 ml rhfgf-bheparină -500 µl amfotericină B -500 µl GA-1000 (gentamicină) -500 µl acid ascorbic (AS) -500 µl VEGF -500 µl R3-IGF µl heparină -500 µl rhegf -200 µl mediu de expansiune hidrocortizon; filtrat steril) -50 ml LBMCM (mediu pe termen lung pentru cultură de măduvă osoasă. Dexter TM; Acta Haematol. 1979; 62 (5-6):) -500 µl SCGF-ß (10 µg/ml) -250 µl VEGF (10 µg/ml) -250 µl Flt3-l (10 µg/ml) soluție stoc de fibronectină (pentru acoperirea plăcilor): -1 mg fibronectină (FN) -1 ml apă sterilă -24 ml tampon PBS MACS -475 ml PBS -12,5 ml ser albumin uman (HSA) -3 ml aqua-citrat-dextroză-A (ACD-A) mediu de oprire (după tripsinizare) pentru celule endoteliale: 20% FCS în mediu bazal EGM-2 sau în super mediu

30 30 LBMCM -400 ml IMDM -50 ml Ser de vițel fetal (FKS) -50 ml Ser de cal (HS) -500 µl Hidrocortizon (HC) Soluție stoc de tripsină: -1 ml Tripsină -9 ml mediu de bază PBS cu adăugare de citokine ca mediu de diferențiere -LBMCM ca mediu de bază Tabelul 6: Prezentare generală a citokinelor adăugate Citokine adăugate VEGF VEGF + Ang-2 VEGF + bfgf VEGF + EGF VEGF + HGF VEGF + IGF-1 VEGF + IL-8 VEGF + bfgf + EGF VEGF + bfgf + HGF VEGF + bfgf + IGF-1 VEGF + bfgf + IL-8 VEGF + bfgf + Ang-2 VEGF + bfgf + EGF + HGF + IGF-1 + IL-8 - EBM-1 ca mediu de bază Tabelul 7: Prezentare generală a materialului utilizat Factori și combinații Citokine adăugate VEGF VEGF + Ang-1 VEGF + Ang-2