Potențialul de diferențiere endodermică, hepatică

1 Potențialul de diferențiere endodermică, hepatică a celulelor stem adulte și embrionare in vitro și in vivo prezentat de absolventa de biotehnologie Annika Wulf-Goldenberg de la Berlin de la Facultatea III Științe de proces de la Universitatea Tehnică din Berlin pentru a obține diploma academică de doctor în inginerie - Dr. Ing. - Comitetul de doctorat aprobat pentru disertație: Președinte: Prof. Dipl.-Ing. Dr. U. Stahl Reporter: Prof. Dr. R. Lauster Reporter: Dr. habil. I. Fichtner reporter: Prof. Dr. J. Kurreck Ziua discuției științifice: 30 martie 2010 Berlin 2010 D 83

2 Vezi, Momo, a spus măturătorul Beppo, este cam așa: Uneori ai un drum foarte lung în față. Crezi că este atât de teribil de lung; nu poți face asta niciodată, crezi. Și apoi începi să te grăbești. Și unul se grăbește din ce în ce mai mult. De fiecare dată când vă uitați în sus, puteți vedea că nu există mai puțin ceea ce ne așteaptă. Și încercați mai mult, vă speriați și, în cele din urmă, sunteți complet respirați și nu mai puteți. Și drumul este încă în fața ta. Nu o poți face așa. Nu ar trebui să te gândești niciodată la întreaga stradă dintr-o dată, știi? Trebuie doar să ne gândim la următorul pas, apoi la următoarea respirație, la următoarea lovitură a măturii. Și întotdeauna numai la următorul. Atunci este distractiv; asta e important, atunci îți faci treaba bine. Și așa ar trebui să fie. Deodată îți dai seama că ai făcut întregul drum pas cu pas. Nici măcar nu ai observat cum, și nu ți-a lipsit respirația. Asta e important. Michael Ende, de la Momo Pentru părinții mei, pentru că m-ai învățat să merg pe strada mea cu curaj și încredere.

5 S u m e n t f a s u n g 5 a celulelor. Cu toate acestea, nu s-a realizat nicio diferențiere clară într-un hepatocit funcțional. Condițiile selectate care induc diferențierea in vitro ale mediului condiționat și ale coculturii au permis celulelor CD34 + să se diferențieze ușor în celule endodermice hepatice. Diferențierea hepatică endodermică poate fi indusă în celulele stem embrionare umane ale liniei SA002 de către sistemele in vitro. Condițiile in vitro selectate arată că contactul direct în co-cultură poate induce diferențierea mai eficient decât mediul condiționat din celulele stem. Cu toate acestea, este necesar să se îmbunătățească protocoalele de diferențiere existente. Modelele in vivo dezvoltate constituie o bază pentru testarea și compararea celulelor diferențiate in vitro.

11 Introducere 11 1 Introducere 1.1 Prezentare generală a diferitelor tipuri de celule stem și a proprietăților lor Celulele stem sunt definite pe baza a două criterii (Verfaillie și colab., 2002): capacitatea de auto-reînnoire și potențialul de a se dezvolta în diferite tipuri de celule. În funcție de vârsta ontogenetică, se face distincția între două tipuri de celule stem: celulele stem embrionare și cele adulte cu potențiale diferite de diferențiere de toti-, pluri-, multi- sau unipotență (vezi Figura 1). Figura 1 Tipuri de celule stem cu potențialul lor de diferențiere O singură celulă stem totipotentă are un potențial de diferențiere nelimitat și capacitatea de a se dezvolta într-un organism complet. Celule stem pluripotente

56 Recenzii 56 au prezentat apoptoză. Unele gene sunt implicate în proliferarea celulară, legarea citokinelor, replicarea ADN-ului, chimiotaxia și hematopoieza (Anexa). Tabelul 10 Profiluri de expresie a genelor reglate în sus selectate ale celulelor CD34 + după 10 zile de cultură în mediu StemSpan, în mediu Gherardi condiționat și în mediu Sautin condiționat comparativ cu celule stem necultive. Termen Gene no StemSpan-Medium Condi. Gherardi-Medium Kondi. Sautin mediu% p Gene nr% p Gene nr% p GO:

proliferarea celulei% 5.54E% 1.41E-06 GO:

proliferarea celulelor mononucleare %% GO:

mitoză% 1.19E% 3.54E% 8.55E-22 GO:

Replicarea ADN %% 5.24E + 10 GO:

ciclu celular% 2.16E% 3.23E% 7.13E-16 GO:

apoptoză% 5.56E% 4.75E% GO:

diferențiere celulară %% GO:

mecanorecept sau diferențiere %% GO:

lizozom% 6.67E% 1.49E% 3.57E + 02 GO:

57 Rezultate 57 Celulele stem cultivate în mediul condiționat de sautină au exprimat un număr similar de gene ca celulele stem din mediul Gherardi condiționat, 604 gene reglate în sus și 1126 gene reglate în jos comparativ cu celulele stem necultivate. În cea mai mare parte, genele care aparțin ciclului celular, stimulul extern, stimularea hormonală și biosinteza steroizilor au fost reglate în sus (Anexă). A existat, de asemenea, o acumulare de gene legate de organizarea microtubulilor-citoscheletici și de biogeneză, cum ar fi MID1IP1 și KIF11. Genele din dezvoltarea epidermică a grupurilor, aderența focală, coagularea sângelui și circulația sângelui au fost, de asemenea, exprimate într-un mod crescut. În acest mediu, s-au găsit majoritatea grupurilor cu profile de transcripție ridicate pentru ciclul celular, replicarea ADN și cromozomi și foarte puține pentru apoptoză. Căile de semnalizare reglate în jos au fost joncțiunea aderență, moleculele de adeziune celulară și căile de semnalizare a receptorilor celulelor B. Mai mult, genele care aparțin nucleului, legarea factorului de transcripție, angiogeneza, legarea MHC clasa I și producția de chemokine au fost exprimate mai puțin decât în celulele stem necultivate. Expresia genelor selectate ale grupării funcționale GO:

58 Rezultate 58 Tabelul 11 Modificări în expresia genelor genelor selectate din baza de date GOTERM_BP_ALL și gruparea funcțională: GO:

61 Rezultate 61 markeri endodermici timpurii, cum ar fi SOX17, sunt exprimați după o perioadă scurtă de cultivare, iar markerii ulteriori, precum albumina, sunt exprimați la un nivel scăzut în celulele stem după o perioadă mai lungă de cultivare. Tabelul 12 Co-cultivarea celulelor stem CD34 + cu celule AML12. RMN a fost izolat în anumite momente și genele selectate au fost determinate cu ajutorul RT-PCR semi-cantitativ (TaqMan). S-a arătat că co-cultura cu celule AML12 reglează în jos celulele CD34 + reglează în jos expresia genică a CD34 și markerii endodermici cresc ușor. Gen 0d 7d 21d CD SOX FOXA AFP CEBPA HNF4A -/+ -/+ n.a. ALB -/+ -/+ + KRT n.a. KRT n.b. GATA4 - - n.a. CDH n.b. GJB1 -/+ ++ n.a. GJA n.b. KRT n.b. Legenda: qrt-pcr: ++++ CT 0,0-4,0; +++ CT 4.1-8.0; ++ CT 8.1-12.0; + 12,1-16,0;

Dacă rezultatele au crescut cu 64, animalele au fost iradiate cu 1,6 Gy dintr-o sursă de 137 cesiu-γ. Șoarecii nul NOD/SCID/IL2Rγ au tolerat, de asemenea, această doză de radiații. Glandele timusului șoarecilor NOD/SCID imunodeficienți au fost foarte mici comparativ cu un șoarece RMN imunocompetent ca martor. De asemenea, nu au prezentat o separare clară a măduvei și a zonelor corticale și au fost hipoplazice (Figura 12). În țesutul timusului, doar foarte puține limfocite au fost vizibile perivascular la animalele de testare imunodeficiente. Timusul șoarecilor nul NOD/SCID/IL2Rγ seamănă cu timusul șoarecilor NOD/SCID. a b Figura 12 Examen histopatologic al timusului unui șoarece RMN imunocompetent (a) și al unui șoarece NOD/SCID imunodeficient (b).

66 rezultate 66 a% celule umane HLA-I pozitive (normalizate), 7 3,2 3,1 2,2 1, min 30 b 80 A 1 A 2 A 3 A 4 60 A1,1 A Medie AB 1 B 2 20 B 3 B 4 Media B 0% celule umane c 20% celule umane Măduvă osoasă PBS SCF zile după aplicare iv Splină PBS SCF zile după aplicare iv Figura 13 Clearance sanguin dependent de timp al celulelor CD34 + aplicate sistemic la șoareci NOD/SCID ( A). 4x10 5 celule CD34 + erau i.v. transplantat la șoareci iradiați. Celulele netratate (linie solidă, albastră) sau celulele pretratate SCF (liniată, linie roșie) au fost analizate prin FACS în circulația sângelui murin după 1, 5 și 20 de minute după aplicare. A fost determinat numărul de celule HLA-I umane pozitive din celulele ingerate. Rezultatele sunt rezultatul unui total de trei experimente. Graficarea pe termen lung a celulelor stem netratate și pretratate cu SCF la șoareci NOD/SCID (b, c). Celulele netratate și pretratate cu SCF au fost i.v. aplicat și măduva osoasă (b) și splina (c) analizate prin citometrie în flux cu anticorpul uman specific HLA-I. Valorile sunt medii ± SEM de 6-9 șoareci per grup.

88 A b c 2µm d e s e ctio ns 88 a b c 2µm d e Figura 27 Expresia markerilor de pluripotență pe celulele stem SA002 nediferențiate. Determinarea imunocitometrică a SSEA-4 (a), TRA-1-60 FITC (b) și Oct-4 (d). Celule SA002 nediferențiate la nivel ultrastructural (c). Celulele se caracterizează printr-un raport mare nucleu-plasmă (nucleu întunecat). Cariograma celulelor stem SA002 p41; Pata Giemsa (e). Cariotipul 47, XX + 13 descris ar putea fi detectat pentru celule. Pentru a verifica cariotipul stabil în timpul cultivării pe termen lung, au fost efectuate analize cariotipice pe linia de celule stem embrionare SA002. Analiza și determinarea cariogramei a fost efectuată de compania IMMD Berlin. Linia de celule stem a fost cultivată cu pasajul 18 și transformată mecanic de 23 de ori până la prima analiză. SA002-