Pregătirea protocolului de calitate inozitol pirofosfați (tradus în germană)

rezumat

Pirofosfații de inozitol joacă un rol important în bolile umane, cum ar fi cancerul, diabetul și obezitatea, totuși mecanismul exact de acțiune este controversat. Lipsa pirofosfaților de inozitol disponibili în comerț face problematice studiile detaliate. Aici descriem un protocol simplu pentru a produce și a izola miligrame de pirofosfat de inozitol.

Abstract

Mio-inozitolul apare în mod natural fie nemodificat, fie în derivați fosforilați mai complecși. Dintre cele mai recente, cele mai frecvente două celule eucariote sunt inozitol pentakisfosfatul (IP 5) și inozitol hexakisfosfatul (acidul fitic sau IP 6). IP 5 și IP 6 sunt precursorii moleculelor de inozitol pirofosfat care conțin una sau mai multe legături pirofosfat 1. Fosforilarea IP 6 produce difoshoinozitol pentakisfosfat (IP 7 sau PP-IP 5) și bisdifoshoinositol tetrakisfosfat (IP 8 sau (PP) 2-IP 4). Pirofosfații inozitolului au fost izolați de toate organismele eucariote până acum au fost studiate. În plus, cele două clase diferite de enzime responsabile pentru sinteza inozitol pirofosfatului sunt foarte conservate în timpul evoluției 2-4.

IP 6 kinaze (IP 6 Ks) au o flexibilitate catalitică enormă, transformând IP 5 și IP 6 în PP-IP 4 și IP 7 sau apoi folosind aceste produse ca substraturi, promovând generarea de molecule complexe 5, 6. Recent, a fost identificată o a doua clasă de enzime producătoare de pirofosfat sub forma proteinei de drojdie VIP 1 (cunoscută și sub numele de PP-IP 5K), care este capabilă să convertească IP 6 în IP 7 și IP 8 7,8.

Pirofosfații de inozitol reglează multe procese celulare disparate, cum ar fi secreția de insulină 9, lungimea telomerilor 10.11, chemotaxia 12, traficul vezicular 13, homeostazia de fosfați 14 și eliberarea gagului HIV-1 15. Au fost propuse două mecanisme de acțiune pentru această clasă de molecule. Ele pot afecta alosteric funcția celulară prin interacțiunea cu anumite proteine, cum ar fi AKT 16. Alternativ, grupul pirofosfat poate dona un fosfat proteinelor fosforilate 17. Potențialul enorm al acestei zone de cercetare este împiedicat de lipsa unei surse comerciale de pirofosfați de inozitol, care împiedică mulți oameni de știință să studieze aceste molecule și această nouă modificare post-translațională. Metodele disponibile în prezent pentru izolarea pirofosfaților de inozitol necesită un aparat cromatografic sofisticat 18,19. Aceste proceduri profită de condițiile acide care pot duce la degradarea inozitol pirofosfatului și, astfel, la o recuperare slabă. De asemenea, procedurile greoaie de desalinizare post-coloană limitează utilizarea lor la laboratoare specializate.

În acest studiu descriem o metodă nesolicitată pentru generarea, izolarea și purificarea produselor reacțiilor IP 6-kinază și PP-IP 5-kinazei. Această metodă a fost posibilă prin capacitatea electroforezei pe gel de poliacrilamidă (PAGE) de a dizolva polifosfați de inozitol cu ​​înaltă fosforilare 20. După reacții enzimatice IP 6 K1 și PP-IP 5 K folosind IP 6 ca substrat, PAGE a fost utilizată pentru a separa pirofosfații inozitolului generați, care ulterior s-au eluat în apă.

Protocol

1. Reacție enzimatică - ziua 1 (1 oră după-amiaza)

  1. Primul pas este de a pregăti 10-20 de reacții enzimatice independente în care IP 6 K1 sau VIP1 convertesc IP 6, izoformele pirofosforilate.
  2. Folosim enzimele His-IP 6 K1 și GST-VIP1 purificate din E. coli conform protocolului descris anterior 17,18.
  3. Pregătiți 50 μl de reacții cu 1x tampon de reacție (30 mM Hepes pH 6,8, 50 mM NaCl, 6 mM MgSO 4, 1 mM DTT), 6 mM fosfocreatină (PCr), 25 U/mL creatină PhosphoKinase (CPK), 5 mM ATP (Mg sare), 0,3 mM IP6, 0,05-0,1 µg His-IP 6 K1 sau GST-VIP1. Reglarea volumului cu MiliQ ddH 2 O.
  4. Rotiți scurt reacția și la 37 ° C peste noapte cu o rotație.

2. Turnarea și încărcarea gelului de poliacrilamidă - Ziua 2 (4 ore după-amiaza)

  1. Gelul de poliacrilamidă este realizat folosind plăci de sticlă de 24 cm lungime, 18 cm lățime și distanțieri de 1,5 mm lățime. De obicei, se folosește un 16 pieptene sau un pieptene cu o singură bandă pregătitoare.
  2. Se prepară un amestec (50 ml/gel) cu următorul conținut: 35,5% (g/v) acrilamidă: bisacrilamidă 19: 1, 1X Tris/borat/EDTA (TBE), 0,05% (g/v) persulfat de amoniu (APS), TEMED 0,05% (g/v). Se toarnă amestecul între plăcile de sticlă prefabricate, se introduce pieptenele și se lasă polimerizarea timp de 30-60 minute la temperatura camerei.
  3. După ce gelul s-a polimerizat, transferați dispozitivele în frigider și în 1X TBE timp de aproximativ 30-60 de minute la 200-300 volți de alimentare.
  4. Adăugați 1X colorant OrangeG (10mM Tris-HCI pH 7,0, 1mM EDTA, 30% glicerină, 0,1% OrangeG) la fiecare reacție. Pregătiți o probă cu 2 nmol de IP 6 ca sarcină de control standard.
  5. Spălați bine fiecare fântână cu tampon de rulare folosind o seringă și un ac de 21G pentru a îndepărta orice precipitat, apoi încărcați gelul. Evitați încărcarea pe partea de bine.
  6. Rulați gelul peste noapte la 450-550 volți (7 MAMP/gel) până când banda de colorant OrangeG se află în ultimii 10 cm de fundul gelului.

3. Izolarea IP 7 - ziua 3 (4 ore) și ziua 4 (uscare SpeedVac 6-7 ore)

  1. Demontați aparatul de gel și îndepărtați cu grijă o placă de sticlă lăsând gelul peste celălalt. Tăiați o porțiune mică de gel chiar deasupra benzii de colorare OrangeG din partea de jos folosind standardul IP-6 și o urmă de probă ca în ilustrația 1 afișate.
  2. Patați porția tăiată a gelului cu albastru de toluidină (0,1% (greutate/volum) albastru de toluidină, 20% (greutate/volum) metanol, 2% (greutate/glicerină) timp de câteva minute (1-3 minute) sau mai mult apare banda inozitol pirofosfat. Puneți din nou placa de sticlă deasupra gelului pentru a preveni uscarea gelului nepătat.

Banda IP-7 ar trebui să fie vizibilă, deoarece funcționează puțin mai lent decât standardul IP-6. ATP care rulează mai repede decât IP 6 ar trebui să fie, de asemenea, vizibil (Ilustrația 1). Transferați porția de gel colorată într-o soluție de colorare (20% (g/v) metanol) timp de câteva minute, spălați excesul de albastru de toluidină și poziționați gelul cu gelul nepătat.

Dacă este necesară vizualizarea izoformelor de inozitol pirofosforilate superioare (IP 8 și IP 9), se colorează gelul cu soluție de colorare cu albastru de toluidină timp de 20 de minute la temperatura camerei. Apoi spălați albastrul de toluidină cu soluția de colorare timp de aproximativ 15 minute.

4. Determinarea concentrației și purității IP 7.

  1. Utilizați 2-5 μl din proba IP 7 recuperată pe un test PAGE gel, similar cu secțiunile 2.2-2.5. Puneți diluții multiple de IP 6 (adică 0,5, 1, 2, 4 nmol) ca standard de concentrație și markeri poli-P de 4 nmoli. După rularea gelului, vizualizați izoformele de inozitol pirofosfat prin colorarea și decolorarea întregului gel cu soluție de albastru de toluidină conform procedurii din secțiunea 3.2. (Figura 2A) descris.
  2. După colorarea cu toluidină, concentrațiile pot fi determinate prin scanarea gelului și compararea diferențelor de intensitate între IP 6 și IP 7, utilizând software de imagistică, cum ar fi: B. Imagine-J, ca în Figura 2B afișate.

5. Rezultate reprezentative:

Conversia enzimatică pregătitoare a IP 6 la 7 prin IP IP 6 K1 și enzimele VIP1 poate fi ușor remediată prin analiza PAGE (Ilustrația 1). Încărcarea IP 6 ca control al mărimii împreună cu colorarea cu albastru de toluidină permite identificarea derivaților pirofosforilați, deoarece aceștia rulează mai lent, în funcție de numărul de grupări fosfat de pe inelul inozitol. Metoda descrisă mai sus permite purificarea simplă a IP 7. Analiza pirofosfatului de inozitol purificat prin PAGE a arătat puritatea IP-ului nostru 7 (Figura 2A). Interesant este faptul că izomerul 1/3PP-IP 5 al produsului IP 7 VIP1 migrează ceva mai lent decât izomerul 5PP-IP 5 al IP 7 generat de IP 6 K1. Utilizarea standardelor IP 6 permite cuantificarea ușoară a concentrației IP 7 purificat (Figura 2B). Înainte de a utiliza IP 7 pentru alte experimente, activitatea sa biologică poate fi evaluată
(Figura 3). 5PP-IP 5 este incubat cu VIP1 și cu IP 7 fosfatază DDP1 (difosfoinozitol polifosfat fosfohidrolază). IP-urile curate 7 la IP 8 ale VIP1 și IP 6 ale DDP1 sunt curățate în mod curent (Figura 3) convertit.

calitate
Ilustrația 1:. Colorarea cu toluidină prin PAGE și izolarea IP-7-Band-Der O parte din gel cu standardul (IP 6) a fost tăiată și colorată cu o soluție de albastru de toluidină. Cele trei benzi reprezintă (de sus în jos) IP 7, IP 6 și ATP. Porțiunea colorată a gelului a fost apoi aliniată cu restul gelului. Aceasta permite localizarea părții de gel cu IP 7, care va fi apoi tăiată și curățată (cutie întreruptă).

calitate
Figura 2: Analiza PAGE a produselor de reacție IP 6 K1 și VIP1. A) Analiza IP 6 (4, 2, 1, 0,5 nmol) cu colorare cu albastru de toluidină a fost utilizată pentru a determina concentrația IP 7 atât a IP 6 K1 (5PP-IP 5) cât și a VIP1 (1/3PP-IP purificat 5) ) Reacții. B) Analiza diagramelor de dispersie pentru a determina concentrația IP purificat 7. Concentrațiile au fost determinate în funcție de intensitatea benzii, calculată cu software-ul ImageJ, în comparație cu cantitățile de IP 6 determinate anterior. Axa X reprezintă intensități, axa Y reprezintă concentrațiile exprimate în nmol.

protocolului
Figura 3: Analiza activității biologice a IP 7 Pentru a determina calitatea IP 7 purificat, am incubat 5PP-IP 5 (IP 6 K1 generat IP 7) cu VIP1 sau cu fosfataza IP 7 DDP1 și apoi am decis să reacționăm la PAGE. Colorarea DAPI și Toluidină a arătat producția preconizată de IP 8 de către VIP1 și conversia IP 7 la IP 6 de către DDP1.

Discuţie

Utilizarea pirofosfatului de inozitol în biochimie este sever limitată de indisponibilitatea comercială a acestor compuși și de sensibilitatea scăzută a metodelor de detectare existente. Combinația dintre PAGE, care permite separarea moleculelor care au un număr diferit de grupări fosfat și de albastru de toluidină (Ilustrația 1), un colorant metacromatic care leagă grupările fosfat permite detectarea ușoară a izoformelor de inozitol pirofosat deschizând noi căi în cercetare 20.

Utilizarea descrisă a tehnologiei PAGE în pirofosfatul de inozitol pentru purificarea produselor din reacția enzimatică efectuată fie de IP 6 K1, fie de VIP1 este o metodă simplă, economică și fiabilă care permite producerea unor cantități mari de IP 7 de înaltă calitate. Metoda descrisă mai sus nu se limitează la purificarea simplă a IP 7, dar modificări minore minore ale protocolului descris pot permite purificarea unei game diferite de pirofosfați de inozitol. Izoformele de inozitol pirofosfat mai mare fosforilate, cu mai mult de opt grupe fosfat, ar putea fi mai detectabile cu IP 7 sau cantități diferite de IP 6 decât substratul 20.6. Acest pirofosfat de inozitol poate fi detectat prin creșterea lungimii culorii și apoi purificat (secțiunea 3.2). În plus, utilizarea IP 5 ca substrat pentru reacția enzimatică ar permite purificarea PP-IP 5 și a altor pirofosfați de inozitol cu ​​o grupare hidroxil pe inelul inozitol.

Ca rezultat, această metodă nesigură permite purificarea fiabilă a cantităților de miligrame de inozitol pirofosfat cu instrumente disponibile pe scară largă și astfel deschide noi căi pentru acest interesant domeniu de cercetare.

Dezvăluiri

Nu s-au declarat conflicte de interese.

Mulțumiri

Mulțumim lui A. Riccio pentru comentarii utile și pentru citirea manuscrisului. Această lucrare a fost susținută de finanțarea Consiliului de cercetare medicală (MRC) pentru Unitatea de biologie celulară și de un grant pentru programul științei frontierei umane (RGP0048/2009-C).