Proliferarea locală duce la acumularea de macrofage în țesutul adipos în obezitate

subiecte

abstract

Acumularea de macrofage de țesut adipos (ATM) este o caracteristică semnificativă a inflamației cronice asociate obezității. De asemenea, este important în reglarea dezvoltării obezității. La animalele slabe, există un număr mic de celule ATM rezidente distribuite între adipocite considerate a fi macrofage M2. În cazul obezității, macrofagele semnificativ crescute se acumulează în țesutul adipos și formează așa-numita „structură asemănătoare coroanei” (CLS) în jurul adipocitelor moarte. 1, 2 Aceste macrofage au fenotipul M1 și produc diferite tipuri de citokine inflamatorii, cum ar fi TNF- & agr; ceea ce duce la răspândirea inflamației datorate obezității și la dezvoltarea unor tulburări metabolice precum rezistența la insulină. 3, 4, 5

În mod tradițional, ATM-urile acumulate sunt privite ca urmare a migrării monocitelor periferice în condiții inflamatorii. Recent, dovezi în creștere au arătat că menținerea macrofagelor tisulare este probabil independentă de completarea monocitelor circulante și chiar independentă de precursorii măduvei osoase. De fapt, diferite tipuri de macrofage tisulare sunt capabile să se reînnoiască și să se reproducă local în stare naivă, cum ar fi microglia, 7, 8, celule Kupffer, 9 și Langerhans. În starea inflamatorie acută, de exemplu în timpul unei infecții parazitare, proliferarea locală a macrofagelor este crescută și aceste macrofage prezintă fenotipuri de macrofage activate alternativ, proces care este controlat de citokinele Th2. 11 În afecțiuni inflamatorii cronice, cum ar fi arterioscleroza, există, de asemenea, o proliferare locală a macrofagelor, care contribuie la acumularea macrofagelor în pereții arteriali. 12 S-a raportat recent că multiplicarea locală a macrofagelor poate contribui la acumularea obezității la bancomate. 13, 14

Rezultate

Acumularea de ATM-uri în stadiile incipiente ale obezității este legată de proliferarea macrofagelor

Acumularea de macrofage în țesutul adipos este asociată cu proliferarea in situ în stadiile incipiente ale obezității. ( A ) Greutatea corporală a șoarecilor hrăniți cu ND și HFD (n = 10 șoareci în fiecare grup). Barele de eroare reprezintă valori medii ± SEM *** P + ATM-uri în eAT de la șoareci pe ND sau HFD. Bara de scalare, 100 μm

Stadiul incipient al obezității genetice este asociat cu proliferarea bancomatelor

Obezitatea este rezultatul unor interacțiuni complexe genă-mediu. Într-un model de obezitate moștenită genetic, șoarecii cu deficit de receptor de leptină (șoareci de lepră db/db, denumiți în mod obișnuit db/db), am examinat nu numai obezitatea legată de dietă, ci și dacă proliferarea in situ a macrofagelor la ATM Acumularea este implicată. șoareci db). Am constatat că acumularea de ATM în țesutul adipos (eAT și iAT) la șoareci de lepră db/db în stadiile incipiente ale obezității (vârsta de 7 săptămâni) crește dramatic în comparație cu cea a colegilor lor heterozigoți (2a). Între timp, macrofagele Ki67 + au fost mult crescute în țesutul adipos al șoarecilor cu lepră în vârstă de 7 săptămâni db/db (2b). De asemenea, am efectuat un test de încorporare a EdU și am constatat că, în stadiile incipiente ale obezității genetice (cu vârsta de 10 săptămâni), s-au observat în mod semnificativ mai multe macrofage încorporate în EdU în țesutul adipos al șoarecilor lepros db/db (Figurile 2c și d). Procentul de EdU încorporat ATM-uri de la șoareci cu obezitate genetică avansată (30 de săptămâni) a fost, de asemenea, semnificativ mai mare decât cel al colegilor slabi. Astfel, proliferarea macrofagelor contribuie la acumularea de ATM în obezitatea genetică.

Pentru comparație, am analizat în continuare nivelul himeric al eozinofilelor din țesutul adipos. Eozinofilele sunt un alt subset de celule mieloide care s-au dovedit a migra din sângele periferic în țesutul adipos și joacă un rol important în menținerea homeostaziei glucozei, 15 care nu proliferează la șoareci obezi sau slabi (Figurile suplimentare S1a și b ). . Spre deosebire de ATM-uri, s-au observat eozinofile evidente derivate din donator (CD45.1 +) în țesutul adipos al șoarecilor obezi atât în ​​stadiile incipiente (HFD de 8 săptămâni), cât și în obezitatea în stadiu târziu (HFD de 12 săptămâni) (Figura 3d)). Din acest motiv, am confirmat că acumularea de ATM este declanșată de proliferarea rezidentă a macrofagelor în stadiul incipient al obezității și promovată în continuare de migrarea monocitelor în stadiul târziu al obezității.

De asemenea, am ridicat o întrebare interesantă: puterea macrofagelor de a prolifera este limitată la bancomatele interne sau poate fi observată și în macrofagele recrutate? Pentru a remedia acest lucru, am efectuat un test de încorporare EdU pe șoareci himerici hrăniți cu HFD timp de 12 săptămâni. Interesant este că atât ATM-urile încorporate CD45.2 + cât și CD45.1 + -Edu au fost detectate în țesutul adipos (Figura 3e), ceea ce indică faptul că macrofagele proliferează indiferent de originea lor. Astfel, multiplicarea locală a macrofagelor rezidente și recrutate contribuie la acumularea de bancomate.

CCL2 nu este necesar pentru acumularea de macrofage în stadiile incipiente ale obezității

Pentru a susține concluzia că proliferarea, nu migrarea monocitelor, joacă un rol crucial în acumularea de ATM în obezitatea timpurie, am analizat expresia locală a CCL2 (MCP-1) în țesutul adipos, care este chimiotratantul central pentru migrarea monocitelor. este. În mod interesant, la colorarea intracelulară am constatat că CCL2 a fost exprimată în principal de celulele stromale CD45 - CD31 în țesutul adipos și nu de leucocite CD45 + sau celule endoteliale CD31 +. Într-adevăr, în nici una dintre cele trei populații de celule derivate din țesutul adipos al șoarecilor obezi, s-a observat o expresie crescută a CCL2 comparativ cu cea a șoarecilor slabi (Fig. 4a). În consecință, nivelul CCL2 din ser nu a fost modificat în stadiile incipiente ale obezității (Figura 4b). Cu toate acestea, la un stadiu ulterior al obezității (HFD> 12 săptămâni), s-a găsit un nivel semnificativ mai mare de CCL2 în ser (Figura 4c). Aceste rezultate arată că migrația monocitelor indusă de CCL2 nu este determinantul acumulării ATM în stadiul incipient al obezității, în timp ce poate regla acumularea ATM într-un stadiu relativ mai târziu al obezității.

ATM-urile proliferative sunt situate de preferință în CLS. ( A ) Imunofluorescența care arată localizarea ATM-urilor Ki67 + la șoarecii obezi induși de HFD. Vârfurile de săgeată marchează bancomatele din afara CLS. Bara de scalare, 100 μm. ( ) Procentul de ATM-uri Ki67 + în CLS și în afara CLS-urilor, unde 225 ATM-uri au fost combinate din 7 imagini de imunofluorescență. *** Bancomatele P + au scăzut treptat odată cu progresia obezității. O analiză detaliată a arătat că expresia RELM- & agr; în Ki67 + - ATM-uri comparativ cu cel din Ki67 - ATM-uri (Figura suplimentară S2). TNF-? + Bancomatele au fost mai întâi crescute și apoi scăzute pe măsură ce obezitatea a progresat. Procentul de Ki67 + TNF- & agr; + ATM-ul este comparabil cu cel al Ki67 - TNF- & agr; + ATM-uri (figura suplimentară S3).

Semnalizarea IL-4/STAT6 este principalul motor din spatele proliferării ATM-urilor

Am investigat în continuare stimulii mitogeni pentru proliferarea ATM. S-a demonstrat că IL-4, 11 M-CSF, 12 și CCL2 13 pot controla proliferarea locală a macrofagelor. Cu toate acestea, când am examinat efectele acestor citokine asupra proliferării ATM, am constatat că doar administrarea de IL-4 poate crește proliferarea ATM la șoarecii slabi. 19 Când IL-4 a fost injectat intraperitoneal la șoareci slabi, a fost observată o creștere dramatică a ATM-urilor Ki67 + (Figura 6a). După legarea la receptorul său, IL-4 activează JAK1 și JAK3 și apoi conduce la fosforilarea STAT6, un factor de transcripție central pentru reacțiile biologice mediate de IL-4. 20 Am constatat că proliferarea indusă de IL-4 a ATM-urilor la șoareci cu deficit de STAT6 a fost grav afectată (Figura 6a), sugerând un rol critic al semnalizării IL-4/STAT6 în ATM-ul condus de IL-4 - Indică proliferarea. Mai important, la șoarecii cu HFD, procentul ATM-urilor Ki67 + la șoarecii cu deficit STAT6 a fost semnificativ mai mic decât la șoarecii WT (6b). Astfel, semnalizarea IL-4/STAT6 este forța motrice din spatele proliferării ATM-urilor în obezitate.

IL-4/STAT6 determină răspândirea bancomatelor. ( A ) Expresia Ki67 în ATM-uri de la eAT de șoareci WT și STAT6 -/-, care au fost expuși la un complex de anticorpi IL-4 și IL-4 (pentru a extinde biodisponibilitatea IL-4 in vivo) sau PBS timp de 48 de ore au fost tratați. ( ) Expresia Ki67 a șoarecilor WT și STAT6 -/- pe HFD în bancomate (n = 10 în fiecare grup). Sunt afișate valorile medii ± SEM

discuţie

Obezitatea a fost legată de acumularea de ATM-uri, care răspândesc inflamația cronică și promovează rezistența la insulină. Rapoartele anterioare au arătat că migrarea monocitelor sanguine contribuie la infiltrarea macrofagelor în locurile inflamate. 1, 16, 21 Dovezi recente sugerează că proliferarea locală joacă, de asemenea, un rol în reglarea acumulării de ATM-uri la persoanele obeze. 13, 14 Cu toate acestea, contribuțiile respective ale acestor două evenimente la acumularea de ATM în timpul progresiei obezității nu au fost abordate. În acest studiu am arătat că proliferarea in situ a macrofagelor rezidente determină acumularea ATM în stadiul incipient al obezității, în timp ce monocitele imigranți contribuie la acumularea ATM într-un stadiu relativ târziu al obezității. În plus, atât macrofagele rezidente, cât și cele recrutate se înmulțesc în țesutul adipos al șoarecilor obezi (rezumat în 7).

Reprezentarea schematică a contribuției proliferării macrofagelor și a recrutării monocitelor la acumularea de ATM în obezitate. La șoarecii slabi, macrofagele rezidente sunt inactive în țesutul adipos și mențin un nivel de bază al celularității prin auto-reînnoire. În stadiile incipiente ale obezității, aceste macrofage rezidente se înmulțesc și conduc la o acumulare de ATM care este controlată de stimuli emiși de adipocite și/sau alte celule imune. În stadiul târziu al obezității, acumularea de ATM este crescută în continuare de macrofagele derivate din monocite, care au și capacitatea de a prolifera. Aceste macrofage proliferante se localizează întotdeauna în CLS și înconjoară adipocitele apoptotice. Nucleii roșii indică faptul că macrofagele se înmulțesc

S-a raportat anterior că infiltrarea monocitelor periferice joacă un rol important în acumularea obezității la bancomate. 1 Fiind una dintre chimiochinele principale în medierea recrutării monocitelor, s-a sugerat că CCL2 (MCP-1) mediază acumularea de ATM în obezitate. 16 Cu toate acestea, un alt raport arată că, în absența CCL2, nu s-a observat nicio reducere a acumulării macrofagelor în țesutul adipos. 22 Aceste rezultate controversate sugerează că migrarea monocitelor nu este singura modalitate de a regla acumularea de macrofage în țesutul adipos în timpul dezvoltării obezității.

Rezultatele noastre arată că macrofagele rezidente se acumulează în țesutul adipos al șoarecilor în fazele slabe și precoce ale obezității. Analiza fenotipului ATM-urilor în timpul progresiei obezității a arătat că un număr semnificativ de macrofage activate alternativ sunt prezente în fazele slabe și precoce ale obezității. Cu toate acestea, în stadiul târziu al obezității, acest tip de macrofag este redus dramatic. Interesant, s-a raportat că macrofagele activate alternativ măresc capacitatea catabolismului lipidic. 24, 25, 26 Prin urmare, macrofagele activate alternativ în stadiile incipiente ale obezității sunt principalele populații rezidente de macrofage cu catabolism lipidic mai specializat decât cel al macrofagelor imigranți.

Pe scurt, am putut determina că acumularea de macrofage în țesutul adipos în timpul obezității este declanșată de proliferarea in-situ a ATM-urilor rezidente și este promovată în continuare de o activare concertată a migrației monocitelor și a proliferării macrofagelor. Observațiile noastre oferă informații despre evoluția inflamației asociate cu obezitatea și ar putea servi drept ghid pentru dezvoltarea strategiilor terapeutice pentru tulburările asociate cu obezitatea.

materiale si metode

Teste pe animale

Șoarecii C57BL/6 au fost cumpărați de la Shanghai Laboratory Animal Center al Academiei Chineze de Științe (Shanghai, China). Șoarecii CD45.1 din fundalul C57BL/6 au fost furnizați cu amabilitate de Dr. Yanyun Zhang de la Institutul de Științe ale Sănătății de la Academia de Științe din China. Șoarecii heterozigoți cu deficiență a receptorului de leptină (Lepr db/+) din fundalul C57BL/6 au fost achiziționați de la Centrul de Cercetare Animal Model al Universității Nanjing (Nanjing, China) și crescuți în laboratorul nostru. Șoarecii STAT6 -/- (C.129S2-Stat6 tm1Gru/J) proveneau din laboratorul Jackson (Bar Harbor, ME, SUA). Toate experimentele au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor al Institutului de Științe ale Sănătății al Institutului de Științe Biologice din Shanghai al Academiei de Științe din China.

Obezitatea indusă de dietă a fost efectuată prin hrănirea șoarecilor în vârstă de 5 săptămâni cu un HFD conținând 60 kcal% grăsime (D12492, Research Diets, New Brunswick, NJ, SUA). Grupul de control a fost alimentat cu ND. Testul de încorporare EdU a fost efectuat folosind kiturile de testare Click-iT-EdU (Life Technologies, Carlsbad, CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Șoarecii au primit 10 um cu 3 ore înainte de sacrificiu. g EdU/g greutate corporală injectată ip. Reacția Click-iT a fost efectuată pe țesutul adipos și analizată prin citometrie în flux și imunohistologie. Pentru a determina contribuția macrofagelor rezidente la acumularea de ATM-uri, abdomenul inferior al șoarecilor CD45.2 anesteziați a fost protejat cu un bloc de plumb gros de 6 cm. Acești șoareci au primit o doză de radiație de 9,5 Gy & ggr; expuse și injectate iv cu 10 7 celule ale măduvei osoase CD45.1. Șoarecii himerici au fost lăsați pentru reconstituire timp de 7 săptămâni înainte de tratamentul dietetic. Pentru a examina rolul IL-4 în proliferarea ATM, fiecărui șoarece i s-a administrat o combinație de 5 µg. g IL-4 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, SUA) și 25 pg. g anticorp IL-4 (clona 11B11, Harlan) bioproduse injectate ip pentru Știință, Indianapolis, IN, SUA) sau analiza PBS și ATM au fost efectuate 48 de ore mai târziu.

Citometrie în flux

EAT și iAT au fost colectate de la șoareci sacrificați, tăiați în bucăți mici și clătite cu PBS timp de 1,5 ore cu 2 mg/ml colagenază I (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) timp de 1,5 ore. Adipocitele plutitoare au fost separate prin centrifugarea suspensiei celulare la 600 × g timp de 10 minute. Paletele au fost resuspendate, filtrate prin site de 70 um și lizate de celule roșii. Suspensia celulară a fost preincubată cu anti-CD16/CD32 (eBioscience, San Diego, CA, SUA) pentru a bloca receptorii Fc înainte de colorarea moleculei de suprafață. Colorarea intracelulară a fost efectuată folosind kituri de fixare și permeabilizare conform instrucțiunilor producătorului (eBioscience). Anticorpii monoclonali de șobolan incluzând F4/80, CD45, CD11b, CD45.1, CD45.2, Ki67 și TNF-a provin de la eBioscience; CD115 și Siglec-F erau de la Biolegend (San Diego, CA, SUA).

Pentru colorarea intracelulară a RELM- & agr; și TNF-? GolgiPlug 1: 1000 (BD Biosciences, San Jose, CA, SUA) a fost adăugat la colagenază în timpul digestiei țesuturilor în bancomate. După colorarea moleculei de suprafață, colorarea intracelulară a fost efectuată folosind un kit de fixare și un kit de permeabilizare conform instrucțiunilor producătorului (eBioscience). Iepure anti-RELM-α (Abcam, Cambridge, MA, SUA) și Alexa Fluor 488 capră conjugată IgG anti-iepure (Life Technologies) au fost utilizate.

Imunohistochimie

Țesutul adipos a fost tăiat în bucăți mici și fixat cu paraformaldehidă 4% timp de 24 de ore la 4 ° C. Apoi s-a efectuat colorarea completă. Pe scurt, probele au fost permeabilizate cu 1% Triton X-100, blocate cu 1% BSA și 3% FBS în PBS și apoi incubate cu anticorpi corespunzători la suprafață sau molecule de miez. În unele experimente, adipocitele au fost contracolorate cu BODIPY 558/568 C12 (Invitrogen).

analize statistice

Datele sunt prezentate ca media ± SEM și semnificația a fost evaluată prin testul t cu două cozi nepereche, dacă nu se specifică altfel. Ne-am uitat la P ATM

---