Purificarea proteinelor - Biologie
Purificarea proteinelor (de asemenea Purificarea proteinelor) se referă la procesul de îmbogățire și purificare a uneia sau mai multor proteine dintr-un amestec biologic complex sau o soluție care conține mai multe biomolecule. Această îmbogățire poate avea loc în mai multe etape succesive de curățare prin utilizarea diferitelor metode de curățare, a căror eficacitate (secvența semnificativă) și eficiența lor (gradul de curățare) sunt monitorizate și cuantificate cu metode analitice.
Principii de separare
Pentru a separa proteinele, se profită de diferitele lor caracteristici datorită secvenței și structurii specifice. În cromatografia cu schimb de ioni și focalizarea izoelectrică acesta este punctul izoelectric, în SDS-PAGE masa moleculară și modificările post-translaționale, în cromatografia de excludere a mărimii și centrifugarea, masa moleculară și conformația. Centrifugarea izopicnică se separă pe baza densității. Cromatografia de afinitate folosește diferențele în afinitate pentru un ligand selectiv sau în constantele de disociere respective. Hidrofobul, faza inversă și cromatografia polară se separă în funcție de polaritatea diferiților aminoacizi polari expuși și de modificările post-translaționale. Precipitația cu săruri cosmotrope [1] din seria Hofmeister, solvenți organici solubili în apă sau temperatura se bazează pe solubilitățile modificate. Extracția cu un extractant (de obicei o fază diferită) sau polietilen glicol [1] se bazează pe polaritate și diferitele solubilități într-un solvent sau detergent, cum ar fi. B. Amestecuri de fenol, cloroform și alcool izoamilic (cu sau fără haotrope cum ar fi tiocianatul de guanidiniu [2]) sau separarea fazelor a soluțiilor de un procent (m/V) de Triton X-114 la 4 ° C. [3] [4] [5] [6]
De obicei, mai multe metode sunt efectuate în serie, selectarea metodei depinde de proprietățile proteinei, de substanțele însoțitoare interferente dependente de metodă pentru procedurile ulterioare și de orice denaturare asociată. Gradele superioare de purificare (sau factorii de purificare) ai unui proces permit un număr mai mic de etape de purificare, de ex. B. cu purificarea tandemă a afinității.
Deoarece proteinele care urmează a fi purificate, în mare parte proteine recombinate, sunt puse în pericol prin inactivare, denaturare sau proteoliză în timpul întreruperii celulare, purificarea proteinelor se efectuează adesea rapid la 4 ° C în prezența inhibitorilor de protează. Unii inhibitori de protează sunt utilizați numai dacă funcția proteinei de purificat nu este afectată sau menținerea funcției sale este nesemnificativă, deoarece pot modifica proteina printr-o legătură covalentă.
Procesul de separare
Cromatografie
- Cromatografia cu schimb de ioni (IEX)
- Cromatografia de excludere a mărimii (SEC)
- Cromatografia de afinitate
- cromatografie polară
- Cromatografie de interacțiune hidrofobă (HIC) și cromatografie în fază inversă (RPC)
Electroforeză
Extracție și precipitații
- extracții în serie
- precipitații seriale
Filtrare
- dializă
- Filtrare cu flux tangențial
- Microfiltrare
sedimentare
- Centrifugarea
- Testele Pulldown
- cu ajutorul anticorpilor: MACS, teste de mărgele și imunoprecipitare
Evaporare
Procedura de verificare
După etapele individuale de purificare a proteinelor, proteinele purificate sunt caracterizate și cuantificate. Eficiența întregii purificări este determinată de echilibru, cu un grad de purificare (ca reciproc al fracției de masă) din masa proteică sau - în cazul enzimelor - poate fi determinat și un grad de purificare din activitățile enzimatice, de ex. B. coeficientul masei totale a proteinei purificate și a masei inițiale a proteinei în cauză în materialul de pornire sau a coeficientului analog format cu activitățile.